Este protocolo describe un método reproducible para el aislamiento de las células primarias de rabdomiosarcoma de ratón, la formación y el tratamiento de la tumoresfera y el trasplante de aloinjertoado a partir de cultivos de tumoresferas.
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Artículo de método
Derivación y tratamiento de tumoresferas a partir de células tumorales primarias aisladas de Rhabdomyosarcomas de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El rabdomiosarcoma (RMS) es el sarcoma de tejido blando más común en niños. Aunque los esfuerzos significativos han permitido la identificación de mutaciones comunes asociadas con la RMS y han permitido la discriminación de diferentes subtipos de SRM, todavía existen grandes desafíos para el desarrollo de nuevos tratamientos para mejorar aún más el pronóstico. Aunque se identifica por la expresión de marcadores miogénicos, todavía hay una controversia significativa sobre si el RMS tiene orígenes miogénicos o no miogénicos, ya que la célula de origen todavía se entiende mal. En el presente estudio, se proporciona un método fiable para el ensayo de tumoresfera para rmS de ratón. El ensayo se basa en las propiedades funcionales de las células tumorales y permite la identificación de poblaciones raras en el tumor con funciones tumorigénicas. También se describen los procedimientos para analizar proteínas recombinantes, integrar protocolos de transfección con el ensayo de tumoresfera y evaluar los genes candidatos implicados en el desarrollo y crecimiento tumoral. Además, se describe un procedimiento para el trasplante de tumoresferas de aloinjertos en ratones receptores para validar la función tumorigénica in vivo. En general, el método descrito permite la identificación y prueba fiables de poblaciones tumorigénicas RMS raras que se pueden aplicar a los RMS que surgen en diferentes contextos. Por último, el protocolo se puede utilizar como una plataforma para la detección de drogas y el desarrollo futuro de terapias.
Introducción
El cáncer es una enfermedad heterogénea; además, el mismo tipo de tumor puede presentar diferentes mutaciones genéticas en diferentes pacientes, y dentro de un paciente un tumor está compuesto por múltiples poblaciones de células1. La heterogeneidad presenta un desafío en la identificación de las células responsables de iniciar y propagar el cáncer, pero su caracterización es esencial para el desarrollo de tratamientos eficientes. La noción de células propagantes tumorales (TPC), una población rara de células que contribuyen al desarrollo tumoral, ha sido previamente ampliamente revisada2. A pesar de que los TPM se han c....
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Protocolo
La vivienda, el tratamiento y el sacrificio de ratones se realizaron siguiendo el protocolo IACUC aprobado del Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.
1. Preparación de reactivos
- Preparar 100 ml de medios de aislamiento celular: Medio F10 complementado con 10% de suero de caballo (HS).
- Preparar 50 ml de solución de colagenasa tipo II: disolver 1 g de polvo de colagenasa tipo II en 50 ml de medios de aislamiento celular (tenga en cuenta las unidades de la enzima por 1 ml de medios, ya que el número de unidades cambia dependiendo del lote). Alícuota la solución y guárdela en un congelador de -20 oC hasta que es....
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Resultados
Detección de tumoresferas
El aislamiento celular se optimizó para obtener la máxima heterogeneidad de las poblaciones celulares presentes en el tejido tumoral. En primer lugar, dado que los tejidos aislados presentaban áreas morfológicamente diferentes, para aumentar las posibilidades de aislar poblaciones uniformes de células raras, se realizó un muestreo de múltiples áreas del tumor(Figura 1A,primer panel a la izquierda). En segundo luga.......
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Discusión
Se han empleado múltiples métodos para el aislamiento y caracterización de los TPC de las poblaciones de células heterogéneas tumorales: ensayos clonogénicos tumorales, aislamiento FACS y ensayo de formación de tumoresfera. El ensayo clonogénico tumoral fue descrito por primera vez en 1971, utilizado para estudios con células madre, y sólo se aplicó posteriormente a la biología del cáncer29,30. Este método se basa en la propiedad intrínseca de las células madre c.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la beca AG-NS-0843-11 de Ellison Medical Foundation y la Beca Piloto NIH dentro de la Subvención de Apoyo del Centro OnCI para el Cáncer P30CA030199 a A.S.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo de disociación celular Accutasa | Gibco | A1110501 | Separe las células adherentes y disocie las tumoresferas |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Citómetro de imagen basado en placa de micropocillos para células adherentes y en suspensión |
| Colagenasa, Tipo II | Life Technologies | 17101015 | Enzima de digestión tisular |
| Dispasa II, proteasa | Life Technologies | 17105041 | Enzima de digestión tisular |
| DMEM medio de alto contenido glucémico | Gibco | 11965092 | Componente de las células tumorales medio |
| DMEM/F12 Medios | Gibco | 11320033 | Componente de los medios de la tumosfera |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Componente del tampón FACS |
| EGF proteína de ratón recombinante | Gibco | PMG8041 | Componente de los medios |
| de la tumosferaFACSAria II Citometría de flujo | BD Biosciences | 650033 | Clasificador de células activadas fluorescentes |
| Suero fetal bovino | Omega Scientific | FB-11 | Componente de las células tumorales Medios |
| Fluriso (Isofluornae) agente anestésico | MWI Vet Supply | 502017 | Reactivo anestésico para animales |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminar células vivas y muertas |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | componente del tampón FACS |
| F10 Media | Life Technologies | Componente 11550043 del tampón FACS | |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Componente de los medios de aislamiento celular |
| Reactivo de transfección Lipofectamine 3000 Reactivo | |||
| de transfección ThermoFisher L3000015Matriz de membrana Matrigel | Corning | CB40234 | Proporciona soporte a las células trasplantadas |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 Componente de los medios de la tumosfera | |
| Neomicina-Polimixina B Sulfatos-Bacitracina Zinc Pomada oftálmica | MWI Vet Supply | 701008 | Ungüento para los ojos PBS |
| Gibco | 10010023 | Componente del tampón FACS y utilizado para lavar las células | |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plásmido |
| Penicilina - Estreptomicocina | Life Technologies | 15140163 | Componente de la tumosfera y las células tumorales |
| medios Recombinantes Humanos y beta; FGF-basic | Peprotech | 10018B | Componente de los medios de tumosfera |
| Ratón recombinante Flt-3 Ligando Proteína | R& D Systems | 427-FL-005 | Proteína recombinante |
| Azul de tripano | ThermoFisher | 15250061 | Discriminar células vivas y muertas |
Referencias
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890....
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Reimpresiones y permisos
