Ensayo In Vitro para estudiar la interacción tumor-macrofago

Resumen

Este artículo representa un ensayo in vitro útil para evaluar la capacidad del medio acondicionado de las células tumorales para atraer macrófagos.

Resumen

Los macrófagos asociados a tumores (AMA) representan un gran porcentaje de células en la masa tumoral para diferentes tipos de cáncer. El glioblastoma (GBM), un tumor cerebral maligno sin cura, tiene hasta la mitad de los MAAs de masa tumoral. Los AMA pueden ser pro-tumorales o antitumorales, dependiendo de la activación de genes específicos en las células. Las mutaciones genéticas en los tumores, a través de la expresión de citoquinas, pueden afectar el reclutamiento de TAM en el microambiente tumoral. Aquí, describimos un ensayo cuantitativo basado en células para evaluar el reclutamiento de macrófagos por el medio acondicionado de las células tumorales. Este ensayo utiliza la línea celular de macrófagos humanos MV-4-11 para estudiar la atracción de macrófagos por el medio acondicionado del glioblastoma, lo que permite una alta reproducibilidad y baja variabilidad. Los datos generados con este ensayo pueden contribuir a una mejor comprensión de la interacción entre el tumor y el microambiente tumoral. Ensayo similar se puede utilizar para evaluar la interacción entre las células tumorales y otras células inmunitarias, incluyendo las células T y las células asesinas naturales (NK).

Introducción

Los macrófagos son células inmunitarias con alta heterogeneidad fenotípica y funcional¹. Desempeñan un papel importante en los sistemas de defensa del huésped, reparación de tejidos, desarrollo y progresión tumoral¹. Los AMA son macrófagos en el microambiente de tumores sólidos. Ciertos AMA pueden promover el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la actividad citotóxica mediada por células T, lamodulación del microambiente tumoral (TME), la promoción de la angiogénesis, invasión y metástasis 2,^3,4,

Protocolo

1. Preparación media

1. Preparación del medio de células madre sin suero
   1. Descongelar el suplemento de 50x B27, el factor de crecimiento epidérmico (EGF, 20 g/ml en ácido acético de 10 mM con 0,1% de BSA), y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, 20 g/ml en ácido acético de 10 mM con 0,1% de BSA).
   2. Añadir 500 l de EGF (concentración final 20 ng/ml), 500 l de FGF (concentración final 20 ng/ml), 10 ml de 50x B27 a 500 ml de mezcla de águila modificada/mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco y 5 ml de 100x penicilina/estreptocina. Invertir el frasco 4-6 veces para mezclar, filtrar el esterilizado a través de un....

Resultados

Los resultados se muestran generalmente a través de gráficos de barras (ejemplo que se muestra en la Figura 1). Las muestras con valores altos de 480/520 indican que los medios acondicionados tienen una alta capacidad para reclutar macrófagos. Dependiendo de la necesidad experimental, se pueden incluir controles adicionales. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos neutralizantes para tratar los medios condicionados para abolir la quimiotaxis de macrófagos.......

Discusión

En este protocolo, hay varios pasos clave: 1) selección de la plaquita Transwell. Para la línea de celda MV-4-11, las plaquitas Transwell de 5 m funcionan bien. Sin embargo, para otras líneas celulares como la línea celular de monocitos comúnmente utilizada THP-1, un tamaño de poro diferente podría funcionar mejor. 2) A medida que las diferentes líneas celulares crecen a diferentes velocidades, es importante ajustar el volumen de los medios acondicionados de acuerdo con los números de celda. Para ello, se pueden utilizar.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.1 μ m vaso de filtración	Thermo fisher	566-0010
0.45 μ unidad de filtro m	Millipore	SLHA033SS
pipetas serológicas de 10 mL	Olympus plastics	12-104
Tubos de centrífuga estériles de 15 mL	Olympus plastics	28-103
Punta de pipeta de 1 mL	ART molecular bioproducts 2779-RI
Pipeta de aspiración de 2 mL	Falcon	357558
placa de 24 pocillos	Millipore	ECM507	Parte de ECM507, o se puede comprar por separado
4x tampón de lisis	Millipore	ECM507	Parte de ECM507, o se puede comprar por separado
5 μ m Inserto Transwell	Millipore	ECM507	Parte de ECM507, o se puede comprar por separado
Matraz de 75 cm2	Corning	430641U
Accutase	Tecnologías de celdas innovadoras	AT-104
B27	Gibco	12587-010
CyQuant Dye	Millipore	ECM507	Parte de ECM507, o se pueden comprar por separado
DMEM	Gibco	11965-092
DMEM:F12	Gibco	10565-018
EGF	Peprotech	AF-100-15
FBS	Gibco	26140
FGF	Peprotech	100-18B
IMDM	Gibco	12440-053
PBS	Gibco	14190-144
Pluma Strep	Gibco	15140-122
Azul Trypan	Biorad	1450021