Visualización de la dinámica del receptor de células T de superficie de cuatro dimensiones mediante la microscopía de hoja de luz de celosía

Summary

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía para visualizar la dinámica de receptores de superficie en células vivas. Aquí se muestran los receptores de células T en CD4⁺ células T primarias.

Abstract

La señalización y la función de una célula están dictadas por las estructuras dinámicas y las interacciones de sus receptores de superficie. Para entender realmente la relación estructura-función de estos receptores in situ, necesitamos visualizarlos y rastrearlos en la superficie celular viva con suficiente resolución espaciotemporal. Aquí mostramos cómo utilizar la microscopía de hoja de luz de celosía (LLSM) recientemente desarrollada para crear imágenes de receptores de células T (TPR) en cuatro dimensiones (4D, espacio y tiempo) en la membrana celular viva. Las células T son una de las principales células efector del sistema inmune adaptativo, y aquí usamos las células T como ejemplo para mostrar que la señalización y la función de estas células son impulsadas por la dinámica y las interacciones de losTPR. LLSM permite imágenes 4D con una resolución espaciotemporal sin precedentes. Por lo tanto, esta técnica de microscopía se puede aplicar generalmente a una amplia gama de moléculas superficiales o intracelulares de diferentes células en biología.

Introduction

La dinámica precisa del tráfico y difusión de moléculas en la superficie celular tridimensional en tiempo real ha sido un enigma a resolver. La microscopía siempre ha sido un equilibrio entre velocidad, sensibilidad y resolución; si uno o dos se maximizan, el tercero se minimiza. Por lo tanto, debido al pequeño tamaño y la inmensa velocidad con la que se mueven los receptores de superficie, el seguimiento de su dinámica ha seguido siendo un gran desafío tecnológico para el campo de la biología celular. Por ejemplo, muchos estudios se han realizado utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)^1,

Protocol

5C. C7 Ratones noqueadores RAG2 transgénicos en B10. Un fondo se utilizó en este estudio de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago.

1. Cosecha y Activa células T

NOTA: Esta parte del protocolo se basa en protocolos anteriores. Véanse las citas para más^{detalles 20,21}.

1. Eutanasia a 10-12 semanas de 5C. Ratón transgénico C7 de ambos sexos (20-25 g) de acuerdo con el protocolo IACUC aprobado (es decir, cámara de CO₂ seguida de luxación cervical).
2. Roc....

Results

Aquí, describimos el aislamiento, la preparación y la creación de imágenes del ratón primario 5C. Células T C7 utilizando un microscopio de lámina de luz de celosía. Durante la sección 3, es imprescindible alinear el microscopio correctamente y recopilar PSF diariamente con el que desconvolver los datos después de la recolección. En la Figura 2,mostramos las imágenes de alineación correctas que se verán al alinear el microscopio. La Figura 2A y .......

Discussion

El protocolo presentado fue optimizado para el uso de células CD4⁺ T aisladas de 5C. Los ratones transgénicos C7 en el instrumento LLSM utilizado, y por lo tanto otros sistemas celulares y LLSM pueden necesitar ser optimizados de manera diferente. Sin embargo, este protocolo muestra la potencia de las imágenes 4D, ya que se puede utilizar para cuantificar la dinámica de un receptor de superficie en una célula entera con la menor distorsión en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, hay muchas posibles aplicaci.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jeringa de 1 mL	BD	309659	para la recolección de células T
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	para cultivo de células T
cubreobjetos redondos de 5 mm	World Precision Instruments	502040	para imágenes
Filtro de células estériles de 70um	Corning	7201431	para la recolección de células T
Alexa Fluor 488 anti-ratón TCR y beta; cadena Anticuerpo	BioLegend	109215	para la obtención de imágenes
de suero fetal bovino (FBS)	X& Cultivo de células Y	FBS-500	para cultivo de células T
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	Reactivo de gradiente Denisty para la recolección de células
T Sal sáldica fluoresceína	Sigma-Aldrich	F6377	Para la alineación del microscopio
FluoSpheres Microesferas modificadas con carboxilato	Thermo Fisher Scientific	F8810	Para la alineación del microscopio
Imaris	Bitplane	N/A	software de seguimiento; Otras opciones de software de rastreo incluyen Amira o Trackmate (Fiji).
Microscopio de lámina de luz reticular	3i	N/A	Microscopio utilizado
Medio L-15 de Leibovitz, sin rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	21083027	para la obtención
de imágenes L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030-081	para el cultivo de células T
LLSpy	Janelia Research Campus	N/A	LLSpy se utilizó bajo licencia del Instituto Médico Howard Hughes, Campus de Investigación Janelia. Póngase en contacto con innovation@janelia.hhmi.org para obtener acceso. Otros métodos de deconvolución y deksewing están disponibles en softwares de procesamiento de imágenes como Fiji, Slidebook, Amira y otros. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Citocromo C (MCC), secuencia ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	Síntesis personalizada	para la recolección de células T
Penacilina/Estreptamicina	Life Technologies	15140122_3683884612	Para el cultivo de células T
Poly-L-Lisina	Productos de investigación de Phenix	P8920-100ML	para la obtención de imágenes
Tampón de lisis RBC	eBioscience	00-4300-54	Para la recolección de células T
Ratón recombinante IL-2	Sigma-Aldrich	I0523	Para cultivo de células
T RPMI 1640 Medio	Corning	MT10040CV	para cultivo de células T
Libro de diapositivas	3i	N/A	LLSM software de imágenes
Herramientas de	disección quirúrgicaNova-Tech International	DSET10	Para la cosecha de células T
Matraces T-25	Eppendorf	2231710126	para el cultivo de células T
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Kits de preparación	Thermo Fisher Scientific	44685	Para la preparación de Fab