El ensayo de la regla de ADN dual se desarrolla para determinar la posición del ARNm durante la translocación ribosoma, que se basa en las fuerzas de disociación de los dúplex de ARN-ADN formados. Con la resolución de un solo nucleótido y la capacidad de llegar a ambos extremos del ARNm, puede proporcionar información mecanicista para la translocación ribosoma y sondear otros desplazamientos de ácido nucleico.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Los gobernantes de ADN dual estudiarán el mecanismo de la translocación ribosoma con resolución de un solo nucleótido
En este artículo
Resumen
Resumen
La translocación ribosoma se refiere al movimiento ribosomal en el ARNm por exactamente tres nucleótidos (nt), que es el paso central en la síntesis de proteínas. Para investigar su mecanismo, existen dos requisitos técnicos esenciales. En primer lugar es la resolución de un solo nt que puede resolver la translocación normal del cambio de cuadro, durante el cual el ribosoma se mueve por otros 3 nt. El segundo es la capacidad de sondear los lados de entrada y salida del ARNm con el fin de dilucidar toda la imagen de la translocación. Informamos del ensayo de la regla de ADN dual que se basa en las fuerzas de disociación críticas de los dúplex de ARN-ADN, obtenidos por espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS). Con una resolución de fuerza de 2-4 pN, el ensayo de regla dual es suficiente para distinguir diferentes pasos de translocación. Mediante la implementación de un vinculador largo en los DN de sondeo, pueden alcanzar el ARNm en el lado opuesto del ribosoma, de modo que la posición del ARNm se puede determinar para ambos lados. Por lo tanto, el ensayo de doble regla es especialmente adecuado para investigar la translocación ribosoma, y el movimiento del ácido nucleico en general. Mostramos resultados representativos que indicaban una conformación de ARNm en bucle y resolvieron la translocación normal del cambio de trama.
Introducción
El desplazamiento biomolecular es un parámetro fundamental en el estudio del mecanismo de las funciones biológicas relacionadas. Un ejemplo particular es la translocación ribosoma1,2, durante la cual el ribosoma se mueve exactamente por tres nucleótidos (nt) en el ARN mensajero (arNM) normalmente, y por uno, dos u otros números de nt excepto tres en el caso de cambio de marco. Por lo tanto, se requiere una resolución de un solo nt del sistema de reglas moleculares para distinguir los diferentes tamaños de paso. Un desafío mayor es sondear el movimiento ribosoma tanto en el lado de entrada como en el de salida.....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de los complejos ribosomas
- Hacer 1.000 mL de tam10 buffer, que consiste en 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-mercaptoetanol), y 0.05% Tween20.
- Preparar las cinco mezclas enumeradas en la Tabla1.
NOTA: El ribosoma era de la cepa MRE60011. EF-Tu: factor de alargamiento termo inestable. EF-Ts: factor de alargamiento termo estable. GTP: trifosfato de guanosina. PEP: fosfo(enol)piruvato. - Incubar las cinco mezclas por separado a 37 oC durante 25 minutos antes de hacer los complejos ribosomas. Preparar los cinco....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La Figura 1 muestra el esquema de detección y las fotografías de los componentes principales. La detección magnética se logra mediante un magnetómetro atómico utilizando el esquema de escaneo (Figura1A)13. La muestra se coloca en una varilla montada en un motor lineal. El motor transporta la muestra al sensor atómico dentro de un escudo magnético, y luego de vuelta al sitio original para su descarga. El magnetómetro atómi.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En nuestro ensayo de doble regla, las cuentas magnéticas desempeñan dos papeles esenciales. En primer lugar, sirven como transductores de fuerza porque la fuerza centrífuga es proporcional a su masa boyante. En segundo lugar, las perlas son portadoras de señal detectadas por un magnetómetro atómico, que actualmente es el sensor magnético más preciso. Combinando la manipulación mecánica y la detección magnética, la técnica FIRMS es capaz de resolver un gran número de interacciones moleculares basadas en sus fuerzas crític.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconoce el apoyo de la Fundación Welch (E-1721).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tira de estireno | Ciudad de la Industria | MS-861 | |
| Portaobjetos de vidrio | Recubrimientos | 60.0 &veces; 4.0 &veces; 0.3 mm3 | |
| Ácido acético | Millipore Sigma | A6283-500ML | |
| 3-Aminopropiltrietoxisilano | UCT especialidades 21400088 | ||
| mPEG-SVA | Laysan Bio | 154-82 | |
| Biotina-PEG-SVA | Laysan Bio | 152-84 | |
| Bicarbonato de sodio | Millipore Sigma | S5761-500G | |
| Pegamento epoxi | Devcon | 31345 | |
| Estreptavidina | ThermoFisher | 434301 | |
| Ácido Fusídico | Millipore Sigma | F0756-1G | |
| Sulfato de neomicina | Millipore Sigma | ||
| Sulfato de Viomicina | Millipore Sigma | 1715000 | |
| Higromicina | invitrogen | 10687-010 | |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941-100G | |
| Acetato de magnesio | Millipore Sigma | M5661-50G | |
| Cloruro de amonio | Millipore Sigma | A9434-500G | |
| Potasio cloruro | Millipore Sigma | P9333-500G | |
| EDTA | GIBCO | 774750 | |
| 2-mercaptoetanol | Millipore Sigma | M6250-500ML | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-250ML | |
| GTP | Millipore Sigma | G8877-100MG | |
| PEP | Millipore Sigma | P7127-100MG | |
| Piruvato quinasa | Millipore Sigma | P1506-5KU | |
| Sacarosa | Millipore Sigma | S7903-5KG | |
| Dynabeads M-280 Estreptavidina | ThermoFisher | 11205D | |
| ARNm Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 133899727 | 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ |
| ADN Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 157468630 | 3?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? |
| ADN Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 164845370 | 3?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5' |
| ADN Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 157468628 | 3?-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5' |
| ADN Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 163472705 | 3?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5' |
| ADN Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 138678130 | 3?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| ADN Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 138678131 | 3?-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| ADN Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 138678132 | 3?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? |
| ADN Oligo | Tecnologías de ADN integradas | 138678133 | 3?-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5' |
| Centrífuga | Eppendorf | 5427R | |
| Micro Ultracentrífuga | Hitachi | CS150FNX | |
| Mezclador de vórtice | VWR | VM-3000 | |
| Amplificador de bloqueo | Research Systems | SR530 | |
| Amplificador de bloqueo | Stanford Research Systems | SR830 | |
| Láser | Newport | TLB-6918-D | |
| Generador de funciones | Stanford Research Systems | DS345 | |
| Fotodetectores | Thorlabs | DET36A |
Referencias
- Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).
- Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Explorar más artículos
Ensayo de regla de ADNespectroscopia de magnetización remanente inducida por fuerzadisociación de dúplex de ARNminmovilización del complejo ribosomalefectos de los antibióticos en la translocacióndetección de desplazamiento del marco de lecturadesplazamiento de ácidos nucleicosconfiguración del magnetómetro atómico
