Evaluación del daño oxidativo en las células madre primarias del ratón/células madre en respuesta al daño ultravioleta-C (UV-C)

Resumen

Este protocolo demuestra la detección simultánea de especies reactivas de oxígeno (ROS), células vivas y células muertas en cultivos primarios vivos a partir de células de superficie ocular de ratón. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodida, y Hoechst tinción se utilizan para evaluar el ROS, las células muertas y las células vivas, respectivamente, seguido de imágenes y análisis.

Resumen

La superficie ocular se somete a un desgaste regular debido a diversos factores ambientales. La exposición a la radiación UV-C constituye un riesgo para la salud en el trabajo. Aquí, demostramos la exposición de las células madre primarias desde la superficie ocular del ratón a la radiación UV-C. La formación reactiva de especies de oxígeno (ROS) es la lectura de la extensión del estrés oxidativo/daño. En un entorno experimental in vitro, también es esencial evaluar el porcentaje de células muertas generadas debido al estrés oxidativo. En este artículo, demostraremos la tinción de 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) de las células madre madre de la superficie ocular primaria del ratón expuestas a UV-C y su cuantificación basada en las imágenes fluorescentes de la tinción DCFDA. La tinción DCFDA corresponde directamente a la generación ROS. También demostramos la cuantificación de células muertas y vivas mediante la tinción simultánea con yoduro de propidium (PI) y Hoechst 3332 respectivamente y el porcentaje de células DCFDA (ROS positivas) e PI positivas.

Introducción

La superficie ocular (OS) es una unidad funcional compuesta principalmente por la capa externa y la epitelia glandular de la córnea, la glándula lacrima, glándula meibomiana, conjuntiva, parte de los márgenes del párpado e inervaciones que transducen las señales^1. La capa corneal transparente en forma de cúpula enfoca la luz en la retina. Este tejido avascular se compone de componentes celulares como células epiteliales, queratocitos, y células endoteliales y componentes acelulares como colágeno y glicosaminoglicanos². El área es drenada por lágrimas que también suministran la mayoría de los nutrientes. La posición anatómica del sistema operativo lo obliga a estar en contacto directo con el entorno externo, a menudo exponiéndolo a varios componentes agresivos como luz brillante, microbios, partículas de polvo y productos químicos. Este factor predispone el sistema operativo a lesiones físicas y lo hace propenso a diversas enfermedades.

El estrés oxidativo se debe al desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los mecanismos endógenos de defensas antioxidantes^3. ROS se clasifican en moléculas reactivas y radicales libres, ambos derivados del oxígeno molecular (O₂) a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial⁴. El primer grupo está compuesto por especies no radicales como el peróxido de hidrógeno (H₂O_2),el oxígeno singlete (¹O₂) y el segundo incluye especies como aniones de superóxido (O₂^-), y radicales hidroxilo (^•OH), entre otras. Estas moléculas son subproductos de los procesos celulares normales y sus funciones se han implicado en funciones fisiológicas importantes como la transducción de señales, la expresión génica y la defensa del huésped^5. Se sabe que se genera una mayor producción de ROS en respuesta a factores como la invasión de patógenos, los xenobióticos y la exposición a la radiación ultravioleta (UV)⁴. Esta sobreproducción de ROS da como resultado estrés oxidativo que conduce al daño de moléculas como ácidos nucleicos, proteínas y lípidos^6.

La luz solar natural, la fuente más predominante de radiación UV, se compone de UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) y UV-C (290–200 nm)⁷. Se ha notificado una correlación inversa entre la longitud de onda y las energías espectrales. Aunque las radiaciones UV-C naturales son absorbidas por la atmósfera, las fuentes artificiales como las lámparas de mercurio y los instrumentos de soldadura emiten y, por lo tanto, constituyen un riesgo ocupacional. Los síntomas de la exposición a los ojos incluyen fotoqueratitis y fotoqueratoconjuntivitis⁸. La producción de ROS es uno de los principales mecanismos para infligir daño celular inducido por rayos UV⁹. En el estudio actual, demostramos la detección de ROS utilizando el método de tinción de diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA) de 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein a través de la enfermedad en células de superficie ocular primarias de ratón/células madre expuestas a UV-C. La fluorescencia verde fue capturada mediante microscopía fluorescente. Las células estaban manchadas con dos colorantes, Hoechst 33342 y yoduro de propidium rojo, para manchar las células vivas y muertas, respectivamente.

Protocolo

El experimento se realizó en células oculares primarias/células madre derivadas del ojo de ratón albino suizo. El uso de animales para la cosecha de los ojos para este experimento fue aprobado por el Comité Institucional de Etica Animal, Yenepoya (considerado como Universidad) (número de aprobación del IEAC, 6a/19.10.2016).

1. Preparaciones de reactivos

NOTA: La derivación de células primarias/células madre de la superficie ocular del ratón está fuera del alcance de este protocolo. Por lo tanto, demostramos las dosis de exposición UV-C, la preparación de reactivos para evaluar ROS, células vivas y muertas y su cuantificación. Consulte la Tabla 1 para conocer los volúmenes respectivos de los reactivos (10% suero bovino fetal, DCFDA, Hoechst y soluciones de stock de yoduro propidium que se añadirán para obtener la solución final de tinción).

1. Preparar una solución de stock de 10 mM DCFDA disolviendo 25 mg de polvo DCFDA en 5.13 mL de DMSO. Aliquot 250 l cada uno en tubos de color ámbar de 1,5 ml y almacenar a -20 oC.
2. Preparar una solución en stock de 10 mg/ml (solución de 16,23 mM) Hoechst 33342 disolviendo todo el contenido del vial de 25 mg en 2,5 ml de agua desionizada. Hacer alícuotas de 100 ml en tubos de microcentrífuga de color ámbar y almacenar a 2-6 oC durante un máximo de 6 meses. Para un almacenamiento a largo plazo, almacene a -20 oC.
3. Preparar una solución en stock de 1 mg/ml de yoduro propidium en agua desionizada, alícuota de 1 ml cada uno en tubos de color ámbar de 1,5 ml, y almacenar a 4 oC.

2. El revestimiento celular y el tratamiento de radiación UV-C

1. Antes del revestimiento, disociar las células de la superficie ocular primaria del ratón aisladas en nuestro laboratorio (resultados inéditos; tales células son una mezcla de epitelial corneal, células estromales y queratocitos) utilizando un agente de disociación celular suave(Tabla de materiales).
2. Placa 0,2 x 10⁶ células de superficie ocular primaria de ratón en 35 mm 0,2% platos de cultivo celular recubierto de matriz de membrana sótano en 2,5 ml de medios completos. Incubar durante la noche a 37oC en una incubadora de_CO2 y humidificada al 5%.
   NOTA: Los medios completos para el cultivo de células primarias de la superficie ocular del ratón se componen de niveles de glucosa alta dMEM que contienen 20% de FBS, 1% de estreptococo, 1% de glutamax, 1% de aminoácido no esencial (NEAA), piruvato sódico al 1% y 0,1% de mercaptoetanol.
3. Antes de exponer las células a varias dosis de UV-C, deseche el volumen máximo de medios y permita que sólo una capa delgada de medios (500 l) permanezca en contacto con las células, lo suficiente para cubrirlas.
4. Lleve los platos, uno a la vez a la fuente/cámara UV-C (la cámara inferior de un horno de hibridación/vinculador cruzado UV; Tabla de Materiales). Coloque el plato en la cámara y retire la tapa del plato. La posición de la tapa abierta del plato garantiza que las células reciban la dosis máxima de UV-C durante la exposición UV-C.
5. Exponga las células a diferentes grados/dosis de UV-C: 1 J/m², 100J/m², 1.000 J/m² y 10.000 J/m².
6. Después de la exposición UV-C, reemplace la tapa de cada uno de los platos inmediatamente y retírelos de la cámara de origen UV-C.
7. Lleve cada uno de los platos a la campana de flujo de aire laminar y rematar cada uno de los platos con 2 ml de medios frescos y completos.
8. Incubar las células durante 3 h en una incubadora de CO₂ de 37oC. Tres horas de incubación después de la exposición a UV-C es óptima para visualizar y cuantificar los efectos tempranos.

3. Preparación de medios de tinción de células vivas

1. Preparar los medios de tinción frescos durante los últimos 15 minutos de la incubación de células de 3 h después de la exposición a UV-C.
2. Precalentado 10 mL de los medios de tinción que contienen 10% FBS-DMEM complementado con 1% Pen-Strep a 37 oC.
3. Añadir 5 sL de 10 mM DCFDA; 5 l de 10 mg/ml de solución de Hoechst y 200 ml de 1 mg/ml de yoduro de propidium. Las concentraciones finales de DCFDA, Hoechst y PI son de 5 m, 5 g/ml y 20 g/ml, respectivamente, en los 10 ml de los medios de tinción.

4. Tinción DCFDA de células oculares primarias de ratón expuestas a UV-C

1. Después de 3 h de incubación de UV-C expuesto células oculares primarias de ratón a varias dosis, aspirar los medios de los platos de 35 mm.
2. Reponer con 2 ml de medios de tinción DCFDA recién preparados a cada uno de los platos suavemente desde los lados.
3. Incubar las células con el medio de tinción durante 15 minutos en la oscuridad en una incubadora de CO₂ de 37 oC para la tinción de células vivas.

5. Visualización de células teñidas DCFDA (ROS), Hoechst y PI

1. Después de la finalización de la incubación, deseche los medios de tinción.
2. Agregue medios completos frescos a las células y observe las células bajo un microscopio fluorescente invertido / imagen celular (Tabla de materiales). Fotografiar los campos deseados: campo brillante, fluorescencia azul, fluorescencia roja, fluorescencia verde.
   NOTA: Las células azules manchadas fluorescentemente son los núcleos, la fluorescencia verde es para las células generadoras de ROS y la fluorescencia roja indica las células muertas PI positivas.

6. Cuantificación de células manchadas (Hoechst-Blue, PI-Dead y Green-ROS) utilizando técnicas de imagen

1. Exporte las imágenes capturadas bajo el microscopio fluorescente invertido/imagen celular a ImageJ para la cuantificación.
2. Abra cada una de las imágenes de una en una, utilizando cada canal (es decir, azul (Nuclei/Hoechst), verde (ROS), rojo (Muerto/PI positivo)) secuencialmente, para contar. Comience desde el control no expuesto y muévase secuencialmente a 1, 100, 1.000 y 10.000 J/m^-2.
3. Cuente las celdas usando la herramienta de recuento de celdas marcada como una cruz en el menú de software para cada uno de los campos [azul positivo (Hoechst positivo; núcleos), rojo positivo (PI positivo; celdas muertas); verde positivo (ROS)] en cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las imágenes correspondientes a cada una de las Tratamientos.
4. Cuente haciendo clic en cada una de las señales específicas en cada uno de los campos. Por ejemplo, al hacer clic en los núcleos manchados azules/Hoechst se dará el número total de núcleos en un campo determinado.
5. Calcular los resultados como el porcentaje de muerte celular por daño UV (número de células PI positivas x 100 dividido por el número de células positivas Hoechst) y el porcentaje de producción de ROS por daño UV (número de células positivas DCFDA x 100 dividido por el número de células positivas Hoechst).

Resultados

DCFDA es un tinte incoloro que es una forma químicamente reducida de fluoresceína utilizada como indicador para detectar ROS en las células. Este tinte queda atrapado dentro de las células y se oxida fácilmente a la diclorodihidrofluoresceína fluorescente (DCF), que emite una fluorescencia verde. Esta fluorescencia se puede detectar mediante microscopía fluorescente. Las células se pueden visualizar y correlacionar con la acumulación de ROS de la siguiente manera: (i) las células vivas sin ROS emiten fluorescencia azul a...

Discusión

El método de tinción DCFDA descrito aquí permite la visualización de ROS en células vivas oculares primarias de ratón tratadas con radiación UV-C. Una ventaja de este método de tinción es que también permite a los investigadores estudiar los efectos inmediatos de UV-C (3 horas después de la exposición UVC) en las células vivas y su enumeración simultánea para el porcentaje de ROS positivo, así como, las células muertas. Además, a medida que el método de tinción se utiliza en las células vivas, las células se pueden incub...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFDA)	Sigma	D6883	El diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína es una sonda fluorogénica y permeable a las células. Se utiliza para la cuantificación de especies reactivas de oxígeno.
Placa de cultivo celular (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Placas estériles para el cultivo de las células.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	El medio de cultivo celular más utilizado, contiene 4500 mg/L de glucosa.
Suero fetal bovino, origen en la UE HiMedia		RM99955	uno de los componentes más importantes de los medios de cultivo celular. Aporta factores de crecimiento, aminoácidos, proteínas, vitaminas liposolubles como la A, D, E y K, hidratos de carbono, lípidos, hormonas, minerales y oligoelementos.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific 35050061		Se utiliza como suplemento y alternativa a la L-glutamina. Ayuda a mejorar la viabilidad y el crecimiento celular.
HL-2000 Hybrilinker	Horno	hibridación UVP
Hoechst 33342	Sigma	B2261	La tinción de Hoechst es permeable tanto a las células vivas como a las muertas. Se une al ADN de doble rayado, independientemente de si la célula está viva o muerta.
Matrigel	Corning		Matriz de membrana basal
MEM Aminoácidos no esenciales (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Se utiliza como suplemento para aumentar el crecimiento y la viabilidad celular.
Penicilina-estreptomicina (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	La penicilina y la estreptomicina se utilizan para prevenir la contaminación bacteriana en el cultivo.
Yoduro de propidio	Sigma	P4170	Colorante fluorescente que solo es permeable a las células muertas. Se une al ADN y ayuda a distinguir entre células vivas y muertas.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Agente de disociación celular suave
ZOE Generador de imágenes celulares fluorescentes	Bio-rad