Artículo de método

Ensayos de actividad basados en RMN para determinar la inhibición compuesta, valores IC50, actividad artifefectiva y actividad de células enteras de ribohidrolasas de nucleósidos

DOI:

10.3791/59928

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30 de junio de 2019

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1Department of Chemistry, Adelphi University, 2Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, 3Department of Chemistry, Boston University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se han desarrollado ensayos de actividad basados en RMN para identificar y caracterizar los inhibidores de dos enzimas ribohidrolasas nucleósidos. Se proporcionan protocolos para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de dilución de salto y ensayos en células enteras de E. coli.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La espectroscopia de RMN se utiliza a menudo para la identificación y caracterización de inhibidores de enzimas en el descubrimiento de fármacos, particularmente en el contexto de la detección de fragmentos. Los ensayos de actividad basados en RMN son ideales para trabajar a concentraciones más altas de compuestos de ensayo necesarios para detectar estos inhibidores más débiles. El rango dinámico y la dispersión de cambios químicos en un experimento de RMN pueden resolver fácilmente las resonancias de sustrato, producto y compuestos de prueba. Esto contrasta con los ensayos espectrofotométricos, en los que los problemas de interferencia de lectura a menudo surgen de compuestos con perfiles de absorción UV-vis superpuestos. Además, dado que carecen de enzimas de reportero, los ensayos de RMN de una sola enzima no son propensos a falsos positivos de ensayo acoplado. Este atributo los hace útiles como ensayos ortogonales, complementando los ensayos tradicionales de cribado de alto rendimiento y los ensayos de triaje de sobremesa. Se proporcionan protocolos detallados para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de saltos-dilución y ensayos en células enteras de E. coli. Los métodos se demuestran utilizando dos enzimas ribohidrolasas nucleósidos. El uso de 1Rmn H se muestra para la enzima específica de la purina, mientras que la RMN de 19F se muestra para la enzima específica de la pirimidina. Los protocolos son generalmente aplicables a cualquier enzima donde las resonancias de sustrato y producto pueden ser observadas y distinguidas por espectroscopia de RMN. Para ser el más útil en el contexto del descubrimiento de fármacos, la concentración final de sustrato no debe ser superior a 2-3x su valor Km. La elección del experimento de RMN depende de la reacción enzimática y los sustratos disponibles, así como de la instrumentación de RMN disponible.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) está bien establecida para caracterizar y controlar las reacciones enzimáticas1,2. Las diferencias en los cambios químicos y los patrones de acoplamiento se utilizan para distinguir las resonancias de sustratos y productos, y se utilizan intensidades de resonancia relativas para cuantificar el porcentaje de reacción. Tanto el consumo de sustrato como la creación del producto se observan directamente en el espectro de RMN. Esto contrasta con la espectrofotometría o espectroscopia de fluorescencia, en la que el curso del tiempo de reacción se indica por un cambio en la absorbancia atribuible a algunas especies químicas que se consumen o crean. Al igual que con los otros métodos, la RMN se puede utilizar para estudiar las reacciones enzimáticas en función de la temperatura, el pH u otras condiciones de la solución, y se pueden determinar los efectos de los inhibidores.

Más recientemente, se han demostrado ensayos de actividad enzimática basados en RMN para el cribado de fragmentos3,4. Los ensayos basados en RMN son ideales para trabajar a concentraciones más altas de compuestos de ensayo (a menudo hasta 1 mM) necesarios para detectar estos inhibidores más débiles. El rango dinámico y la dispersión de cambios químicos en el experimento de RMN pueden resolver fácilmente las resonancias de sustrato, producto y compuestos de prueba. Esto se compara favorablemente con los ensayos espectrofotométricos donde los problemas de interferencia de lectura a menudo surgen de compuestos con perfiles de absorción UV-vis superpuestos. Además, dado que carecen de enzimas de reportero, los ensayos de RMN de una sola enzima no son propensos a falsos positivos de ensayo acoplado. Esta ventaja los hace útiles como ensayos ortogonales, complementando losensayos tradicionales de cribado de alto rendimiento y los ensayos de triaje de sobremesa 5.

En nuestro laboratorio de investigación, los ensayos de actividad basados en RMN se utilizan para identificar y evaluar inhibidores de las ribohidrolasas nucleósidos trichomonas vaginales. El parásito T. vaginalis causa la enfermedad de transmisión sexual no viral más prevalente6. El aumento de la resistencia a las terapias existentes7 está impulsando la necesidad de nuevos tratamientos basados en mecanismos, con enzimas esenciales de la vía de salvamento de nucleósidos que representan objetivos principales8. Se han desarrollado ensayos de actividad basados en RMN tanto para enzimas específicas de pirimidina como para purina, ribohidrolasa de nucleósido de uridina (UNH)9y adenosina/guanosina que prefiriendo ribohidrolasa nucleósido (AGNH)10. Las reacciones catalizadas por estas dos enzimas se muestran en la Figura1. Los ensayos de RMN se utilizan para examinar bibliotecas de fragmentos para puntos de partida químicos, determinar valores IC50 e eliminar los inhibidores de unión covalente o basados en la agregación11. Los mismos ensayos también se están traduciendo para evaluar la actividad enzimática en células enteras12.

Se proporcionan protocolos detallados para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de saltos-dilución y ensayos en células enteras de E. coli. Los protocolos son generalmente aplicables a cualquier enzima en la que las resonancias de sustrato y producto pueden ser observadas y distinguidas por espectroscopia de RMN. Se han hecho tres suposiciones para la simplicidad. En primer lugar, no se especifica el sustrato. Para que los ensayos de actividad basados en RMN sean útiles, la concentración final de sustrato no debe ser superior a 2-3 veces el valor Km 4. En los ejemplos mostrados, las concentraciones finales de adenosina y5-fluorouridina son de 100 m (Km a 54 m) y 50 m (Km a 15 m), respectivamente. En los protocolos, el logro de estas concentraciones corresponde a 12 ml de adenosina de 5 mM o 12 oL de 2,5 mM 5-fluorouridina.

En segundo lugar, se eligió la cantidad de enzima prevista en los protocolos, de 5 ml, para corresponder a la cantidad necesaria para dar lugar a una conversión aproximada del 75% del sustrato al producto en 30 min. Esta cantidad normalmente representa una gran dilución de un stock de enzimas purificadas, y la dilución debe determinarse de antemano para cada enzima. Las soluciones de stock de enzimas AGNH y UNH purificadas se almacenan a -80 oC en alícuotas que proporcionan suficiente enzima para varios miles de reacciones. Por lo tanto, el factor de dilución idealmente sólo necesita ser determinado o validado cada pocos meses. En tercer lugar, no se especifica el experimento específico de RMN 1D. En los resultados representativos, se muestra 1H NMR para AGNH10 y 19F NMR para UNH9, con el experimento de RMN descrito en las referencias correspondientes. La elección del experimento de RMN depende de la reacción enzimática y los sustratos disponibles, así como de la instrumentación de RMN disponible. Por último, cabe señalar que el enfoque experimental descrito no se adhiere a los estrictos requisitos de RMN cuantitativa (qNMR)13,14. En el protocolo, se determina una reacción porcentual utilizando los cambios relativos en la intensidad de la misma resonancia en cada espectro, en lugar de determinar las concentraciones absolutas. Este enfoque elimina la necesidad de adquisición de datos y modificaciones de procesamiento, así como estándares internos o externos, que son necesarios para qNMR.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ensayos compuestos de ensayo inicial a 500 m y 250 m

  1. Preparar el sustrato y el compuesto de prueba para las reacciones.
    1. Preparar soluciones de stock de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) en agua y compuesto de prueba de 50 mM en dimetilsulfóxido desentramado (DMSO). Consulte la sección de introducción para conocer las concentraciones de solución de sustrato a utilizar.
    2. Añadir 12 ml de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) a cada uno de los cuatro tubos de microfusión de 1,5 ml, 1-4.
    3. Añadir 6 l de DMSO deuterated a los tubos 1 (control de 0 min) y 4 (30 min de control). Añadir 6 l de compuesto de ensayo al tubo 2. Añadir 3 l de compuesto de ensayo y 3 l de DMSO deuterated al tubo 3.
  2. Preparar suficiente solución de stock de reacción.
    NOTA: La solución en stock es para cinco reacciones que contienen cada una 517 ml de tampón, 60 ml de óxido de deuterio y 5 ml de solución enzimática (AGNH o UNH). Consulte la sección de introducción para conocer las concentraciones de solución enzimática que se va a utilizar.
    1. Añadir 2,59 ml de tampón de reacción (50 mM de fosfato de potasio, 0,3 M KCl, pH 6,5) a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 300 l de óxido de deuterio al tubo cónico. Añadir 25 ml de solución enzimática (AGNH o UNH) al cónico.
    2. Invierta suavemente el tubo cónico dos veces para mezclar.
  3. Inicie y atemple simultáneamente la reacción de control de 0 min. Transfiera 582 ml de la solución de material de reacción a un tubo de microfúctil limpio. Añadir 10 ml de 1,5 M HCl a este tubo de microfúctil. Transfiera el tubo combinado de 592 l a un tubo de microfusión 1. Aspirar y dispensar la muestra dos veces de una manera lenta pero deliberada.
  4. Iniciar y ejecutar las tres reacciones restantes de manera escalonada. En el momento 0 min, transfiera 582 l de la solución de material de reacción al tubo de microfúctil 2. Aspirar y dispensar la muestra dos veces de una manera lenta pero deliberada. Repita a intervalos de 30 s para los tubos de microfuga 3 y 4. Espera 30 min.
  5. Aplacar las reacciones. En el tiempo 30 min, añadir 10 s l de 1,5 M HCl al microhumo 2. Repita a intervalos de 30 s para los tubos de microfuga 3 y 4. Transfiera 600 ml de solución de cada microfúge a tubos de RMN.
  6. Adquiera un espectro de RMN 1D en cada muestra. Procese los datos para garantizar la eliminación correcta de la especificación y las líneas base planas.
  7. Calcular el porcentaje de conversión de sustrato para espectros de control.
    1. Superponer los espectros para controles de 0 min y 30 min. Escale la señal de sustrato en el control de 0 min para que coincida con el control de 30 min. Anote este porcentaje.
    2. Calcule la conversión porcentual como (100 – porcentaje determinado en el paso 1.7.1).
  8. Calcular el porcentaje de conversión de sustrato para reacciones que contienen compuesto de prueba.
    1. Espectros de superposición para el control de 0 minutos y la primera reacción que contiene el compuesto de prueba de 500 M. Escale la señal de sustrato en el control de 0 min para que coincida con el espectro con el compuesto de prueba. Anote este porcentaje. Calcular la conversión porcentual como (100 – porcentaje determinado).
    2. Repita el procedimiento para la segunda reacción que contenga el compuesto de prueba de 250 M.
  9. Calcule el porcentaje de reacción y el porcentaje de inhibición para cada concentración compuesta de prueba.
    1. Calcule la reacción porcentual como (1.8.1/1.7.2) x 100.
    2. Calcule el porcentaje de inhibición como (100 – porcentaje determinado en el paso 1.9.1).

2. Determinación de los valores de IC50

  1. Preparar el sustrato y el compuesto de prueba para las reacciones.
    1. Preparar soluciones de stock de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) en agua y 10 mM de compuesto de prueba en DMSO deuterated. Consulte la sección de introducción para conocer las concentraciones de solución de sustrato a utilizar.
  2. Preparar diluciones en serie de compuesto de prueba de 10 mM (en DMSO deuterated).
    1. Añadir DMSO deuterated de 36 l a cinco tubos de microfúgeo de 1,5 ml, 1-5.
    2. Agregue el compuesto de prueba de 12 l 10 mM al tubo 1 y toque ligeramente para mezclar. El compuesto de prueba es ahora 2,5 mM.
    3. Transfiera 12 s l del tubo 1 al tubo 2 y toque ligeramente para mezclar. El compuesto de prueba es ahora 0,63 mM. Transfiera 12 s l del tubo 2 al tubo 3 y toque ligeramente para mezclar. El compuesto de prueba es ahora 0,16 mM. Transfiera 12 s l del tubo 3 al tubo 4 y toque ligeramente para mezclar. El compuesto de prueba es ahora 0,04 mM. Transfiera 12 s l del tubo 4 al tubo 5 y toque ligeramente para mezclar. El compuesto de prueba es ahora 0,01 mM.
  3. Prepare 14 tubos de microfusión de 1,5 ml para reacciones.
    1. Añadir 12 ml de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) a cada uno de los 14 tubos de microfusión de 1,5 ml, 1-14.
    2. Añadir 12 l de DMSO deuterated a los tubos 1 (control de 0 min) y 14 (30 min de control).
    3. Añadir 12 l de compuesto de ensayo de 10 mM a los tubos 2 y 3. Añadir 12 l de compuesto de ensayo de 2,5 mM a los tubos 4 y 5. Añadir 12 sl de compuesto de ensayo de 0,63 mM a los tubos 6 y 7. Añadir 12 ml de compuesto de ensayo de 0,16 mM a los tubos 8 y 9. Añadir 12 ml de compuesto de ensayo de 0,04 mM a los tubos 10 y 11. Añadir 12 ml de compuesto de ensayo de 0,01 mM a los tubos 12 y 13.
  4. Preparar suficiente solución de stock de reacción para ejecutar 15 reacciones que contengan 511 ml de tampón, 60 ml de óxido de deuterio y 5 ml de solución enzimática (AGNH o UNH) cada una. Consulte la sección de introducción para conocer las concentraciones de solución enzimática que se va a utilizar.
    1. Añadir 7,67 ml de tampón de reacción (50 ml de fosfato de potasio, 0,3 M KCl, pH a 6,5) a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 900 l de óxido de deuterio al tubo cónico. Añadir 75 ml de solución enzimática (AGNH o UNH) al cónico.
    2. Invierta suavemente el tubo cónico 2x para mezclar.
  5. Siga los pasos descritos en los pasos 1.3–1.9 a (utilizando 576 ml de solución de stock de reacción) para determinar el porcentaje de reacción para cada concentración de compuesto de ensayo.
  6. Calcule el valor ic50 con GraphPad Prism.
    1. Crear una tabla de datos que correlacione el registro de las concentraciones compuestas de prueba de reacción (200 m, 50 m, 12,5 m, 3,13 m, 0,78 m, 0,20 m) con una reacción porcentual (dos valores cada uno).
    2. Utilice un ajuste de curva no lineal para determinar el valor IC50 y el error estándar.

3. Ensayos de pantalla de contador de detergente a 100 m y 50 m

  1. Preparar el sustrato y el compuesto de prueba para las reacciones.
    1. Preparar soluciones de stock de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) en agua y 10 mM de compuesto de prueba en DMSO deuterated. Consulte la sección de introducción para conocer las concentraciones de solución de sustrato a utilizar.
    2. Añadir 12 ml de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) a cada uno de los ocho tubos de microfusión de 1,5 ml, 1-8.
    3. Añadir 6 l de DMSO deuterated a los tubos 1 y 5 (controles 0 min) y 4 y 8 (controles de 30 min). Añadir 6 l de compuesto de ensayo a los tubos 2 y 6. Añadir 3 l de compuesto de ensayo y 3 l de DMSO deuterated a los tubos 3 y 7.
  2. Preparar suficiente solución de stock de reacción SIN detergente para ejecutar cinco reacciones que contengan 517 ml de tampón, 60 ml de óxido de deuterio y 5 ml de solución enzimática (AGNH o UNH) cada una. Consulte la sección de introducción para conocer las concentraciones de solución enzimática que se va a utilizar.
    1. Añadir 2,59 ml de tampón de reacción (50 mM de fosfato de potasio, 0,3 M KCl, pH a 6,5) a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 300 l de óxido de deuterio al tubo cónico. Añadir 25 ml de solución enzimática (AGNH o UNH) al cónico.
    2. Invierta suavemente el tubo cónico 2x para mezclar.
  3. Preparar suficiente solución de stock de reacción CON 0,01% v/v Triton X-100 detergente para ejecutar cinco reacciones que contengan 517 ol de tampón, 60 l de óxido de deuterio y 5 l de solución enzimática (AGNH o UNH) cada una.
    1. Añadir 2 ml de detergente Triton X-100 a 20 ml de tampón de reacción (50 ml de fosfato de potasio, 0,3 M KCl, pH a 6,5). Las soluciones detergentes deben utilizarse en el plazo de 1 día.
    2. Añadir 2,59 ml de tampón de reacción que contenga un 0,01% de detergente Triton X-100 a un tubo cónico de 15 ml. Añadir 300 l de óxido de deuterio al tubo cónico. Añadir 25 ml de solución enzimática (AGNH o UNH) al cónico.
    3. Invierta suavemente el tubo cónico 2x para mezclar.
  4. Para los tubos 1–4, utilizando la solución de stock de reacción SIN detergente, siga los pasos descritos en los pasos 1.3–1.9 para determinar el porcentaje de inhibición para cada concentración de compuesto de ensayo.
  5. Para tubos 5–8, utilizando la solución de stock de reacción con un detergente Triton X-100 de 0,01% v/v, siga los pasos descritos en los pasos 1.3–1.9 para determinar el porcentaje de inhibición de cada concentración de compuesto de ensayo.

4. Ensayos de pantalla de contador de dilución de salto

  1. Preparar el sustrato y los compuestos de prueba para las reacciones
    1. Preparar soluciones de stock de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) en agua y 10 mM de compuesto de prueba en DMSO deuterated. Consulte la sección de introducción para conocer las concentraciones de solución de sustrato a utilizar.
    2. Añadir 53,8 l de tampón de reacción (50 mM de fosfato de potasio, 0,3 M KCl, pH a 6,5) a dos tubos de microhumo de 1,5 ml (cada uno), 1 y 2. Añadir 5 ml de enzima (AGNH o UNH) a los tubos 1 y 2.
    3. Añadir 511 l de tampón de reacción a dos tubos de microfúgede de 1,5 ml, 3 y 4 (cada uno). Añadir 60 ml de óxido de deuterio a los tubos 3 y 4. Añadir 5 ml de enzima (AGNH o UNH) a los tubos 3 y 4.
    4. Añadir 1,2 l de DMSO deuterated al tubo 1 (control de 30 minutos). Añadir 1,2 l de compuesto de ensayo al tubo 2. Añadir 12 l de DMSO deuterated al tubo 3 (control de 30 minutos). Añadir 12 l de compuesto de ensayo al tubo 4. Incubar durante 30 min.
  2. Prepare dos tubos de microfusión de 1,5 ml con solución de dilución.
    1. Añadir 468 ml de tampón de reacción a cada uno de los dos tubos de microfúgede de 1,5 ml, 5 y 6. Añadir 60 ml de óxido de deuterio a cada tubo (5 y 6).
  3. Prepare cuatro tubos de microfusión de 1,5 ml para las reacciones.
    1. Añadir 12 ml de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) a cada uno de los cuatro tubos de microfusión de 1,5 ml, 7-10.
  4. Realice saltos-diluciones e inicie las reacciones.
    1. Transfiera 528 ml de solución del tubo 5 al tubo 1. Aspirar y dispensar la muestra dos veces de una manera lenta pero deliberada. Transfiera 528 ml de solución del tubo 6 al tubo 2. Aspirar y dispensar la muestra dos veces de una manera lenta pero deliberada.
    2. En el momento 0 min, transfiera 588 ml de solución del tubo 1 al tubo 7. Aspirar y dispensar la muestra 2x de una manera lenta pero deliberada. A intervalos de 30 s, transfiera 588 s de solución del tubo 2 al tubo 8, del tubo 3 al tubo 9 y del tubo 4 al tubo 10. Aspirar y dispensar la muestra dos veces de una manera lenta pero deliberada. Espera 30 min.
  5. Para los tubos 7–10, siga los pasos descritos en los pasos 1.5–1.9 para determinar el porcentaje de inhibición para cada concentración de compuesto de prueba.

5. Ensayos compuestos en células enteras de E. coli

  1. Preparar 10 ml de cultivo nocturno de E. coli el día anterior a los experimentos.
  2. Prepare las células de E. coli para los experimentos de RMN.
    1. Centrifugar las células en alícuotas de 1 ml durante 10 min a 15.000 x g.
    2. Deseche el sobrenadante y resuspenda cada alícuota de células en 1 ml de tampón de reacción (50 mM de fosfato de potasio, 0,3 M de KCl, pH a 6,5) por vórtice.
  3. Siga las secciones 1 o 2 para el ensayo deseado con los siguientes cambios:
    1. Sustituya 280 ml de tampón en la solución de stock de reacción por 280 ml de células resuspendidas.
    2. Sustituya 5 ml de enzima (AGNH o UNH) en la solución de stock de reacción por 5 ml de tampón.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Figura 2 muestra los resultados para la prueba de dos compuestos contra AGNH utilizando 1H NMR siguiente sección 1. La reacción enzimática se observa y cuantifica más fácilmente por la desaparición de resonancias de adenosina singlet y doblete a 8,48 ppm y 6,09 ppm, respectivamente, y la aparición de una resonancia singlet de adenina a 8,33 ppm como se observa en el control de 30 minutos Espectro. En presencia de 500 M compuesto 1, no se forma ningún producto como lo demuestra ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los protocolos descritos son generalmente aplicables a muchas enzimas, siempre que los sustratos y/o productos tengan señales resoluibles en el espectro de RMN. Sin embargo, es fundamental que la concentración de sustrato esté cerca de su valor Km y lo suficientemente alta como para ser detectada en un experimento de RMN dentro de un período de tiempo razonable. Una concentración de sustrato no superior a 2-3 x el valor Km es óptima para detectar inhibidores competitivos, no compet...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. Dean Brown por proporcionar compuestos de la biblioteca de fragmentos de AstraZeneca y al Dr. David Parkin por proporcionar las enzimas AGNH y UNH. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R15AI128585 a B. J. S. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.La investigación también fue apoyada por una beca de investigación de verano Horace G. McDonell otorgada a S. N. M., una familia Landesberg Beca otorgada a J. A. G., y Becas de Desarrollo Docente y Premio de Investigación Frederick Bettelheim de la Universidad de Adelphi a B. J. S.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AGNHPurificadointernamente N/ATVAG_213720
UNHPurificado internamenteN/ATVAG_092730
AdenosinaSigmaA9251
5-FluorouridinaSigma F5130
Dimetilsulfóxido-D6Cambridge Isotope LabsDLM-10-100D, 99.9%
Fosfato de potasio monobásicoSigmaP0662
Fosfato de potasio dibásicoSigmaP3786
Cloruro de potasioSigmaP9541
Óxido de deuterioCambridge Isotope LabsDLM-4-100D, 99.9%
Ácido clorhídricoFisher ChemicalA144212
Triton X-100SigmaX100
3-(trimetilsilil)propiónico-2,2,3,-d4 sal sódica ácida (TSP)Sigma269913D, 98%
2,2,2-trifluoroetanol-1,1-d2Sigma612197D, 99,5%
PipetaGilsonF123602PIPETMAN Classic P1000
PipetaGilsonF123601PIPETMAN Classic P200
PipetaGilsonF123600PIPETMAN Classic P20
Tubos de microfugaFisher Scientific05-408-129
Tubos cónicosCorning352099
MicrocentrífugaEppendorf5418
Mezclador de vórticeFisher Scientific02215365
tubos de RMNNorell502-7O según corresponda para la RMN
Espectrómetro de RMNBrukerN/ AAvanceIII500
Prism softwareGraphPadN/AVersión 5.04

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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