La proliferación es una parte crítica de la función celular, y una lectura común utilizada para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Por lo tanto, la medición de la proliferación es un ensayo frecuentemente utilizado en la biología celular. Aquí presentamos un método simple y versátil de medición de la proliferación que se puede utilizar en células adherentes y no adherentes.
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Artículo de método
Medición de la proliferación de células musculares lisas vasculares mediante la química de clics
En este artículo
Resumen
Resumen
La capacidad de una célula para proliferar es integral a la función normal de la mayoría de las células, y la desregulación de la proliferación está en el corazón de muchos procesos de la enfermedad. Por estas razones, la medición de la proliferación es una herramienta común utilizada para evaluar la función celular. La proliferación celular se puede medir simplemente contando; sin embargo, se trata de un medio indirecto para medir la proliferación. Un medio común de detectar directamente las células que se preparan para dividir es mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Estos incluyen el nucleósido radioactivo analógico 3H-timidina más análogos nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2' deoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiuridina (EdU). La incorporación de EdU se detecta por química de clic, que tiene varias ventajas en comparación con BrdU. En este informe, proporcionamos un protocolo para medir la proliferación mediante la incorporación de EdU. Este protocolo incluye opciones para varias lecturas, junto con las ventajas y desventajas de cada una. También discutimos los lugares donde el protocolo se puede optimizar o modificar para satisfacer las necesidades específicas del experimento planeado. Por último, tocamos las formas en que este protocolo básico se puede modificar para medir otros metabolitos celulares.
Introducción
La proliferación es una parte crítica de la función celular1,2. El control de la proliferación influye en procesos normales como el desarrollo y en procesos patológicos como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares. El crecimiento hiperplástico de las células musculares lisas vasculares, por ejemplo, se cree que es un precursor de la aterosclerosis3. Los cambios en la proliferación celular también se utilizan para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Dado su impacto generalizado, la medición de la proliferación es un pilar de muchos laboratorios basados en la biología....
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Protocolo
1. Detección de EdU usando etiqueta fluorescente
- Soluciones de stock
- Prepare una solución de stock EdU de 5 mM añadiendo 12,5 mg de EdU a 10 ml de DobleE2O destilado.
- Preparar los componentes de la solución de etiquetado: 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg en 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg en 1 mL H2O; hacer fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azida (1 mg en 95,3 mL H 2 O 2 O 2 O2O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O ....
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Resultados
En la Figura 2,demostramos los resultados de tres experimentos diferentes que miden la proliferación de VSMC en respuesta al PDGF. Después de cultivar las células en medios formulados para smCs, llevamos a cabo el experimento en DMEM libre de suero, para eliminar cualquier efecto potencial de los factores séricos o de crecimiento en la proliferación. En la Figura 2A comparamos los resultados, del mismo experimento, utilizando una lectura fluorescente vs luminisc.......
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Discusión
La incorporación de EdU es una forma sencilla y directa de medir la proliferación celular; es particularmente útil para las células adherentes13. Nuestro protocolo utiliza células musculares lisas, pero es aplicable a cualquier célula adherente (epitelial, endotelial, etc.). Aunque el protocolo no es complicado, el único paso crítico es hacer que la solución de etiquetado sea: los ingredientes deben agregarse en el orden indicado. Además, al igual que las manchas occidentales quimioluminiscentes, .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Katie Carroll por la asistencia técnica. También damos las gracias al Dr. David Cool y al Laboratorio de Análisis de Proteómica por la instrucción y el suministro del lector de placas de imágenes Cytation. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Estatal Wright (a L.E.W.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-etinil-2'-desoxiuridina | Carbosynth | NE08701 | |
| biotina picolil azida Click | Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Lector de placas de citación | Microscopio Biotek | ||
| EVOS | Thermo Fisher Scientific | ||
| Solución de peróxido de hidrógeno | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbato | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Sondas listas para la tinción de celda fija | Invitrogen | R37606 | DAPI tinción nuclear |
| Tampón de bloqueo Odyssey | Li-Cor | 927-40000 | tampón |
| de bloqueoServicios de | microscopía electrónica | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Cloruro de sodio | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Estreptavidina Rábano picante Peroxidasa Conjugado | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | Sustrato ELISA |
| Lector de placas Synergy Biotek | |||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Clorhidrato de hidroximetilaminometano (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
Referencias
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell ....
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Reimpresiones y permisos
