Artículo de método

Medición de la proliferación de células musculares lisas vasculares mediante la química de clics

DOI:

10.3791/59930

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30 de octubre de 2019

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1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

En este artículo

Resumen

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La proliferación es una parte crítica de la función celular, y una lectura común utilizada para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Por lo tanto, la medición de la proliferación es un ensayo frecuentemente utilizado en la biología celular. Aquí presentamos un método simple y versátil de medición de la proliferación que se puede utilizar en células adherentes y no adherentes.

Resumen

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La capacidad de una célula para proliferar es integral a la función normal de la mayoría de las células, y la desregulación de la proliferación está en el corazón de muchos procesos de la enfermedad. Por estas razones, la medición de la proliferación es una herramienta común utilizada para evaluar la función celular. La proliferación celular se puede medir simplemente contando; sin embargo, se trata de un medio indirecto para medir la proliferación. Un medio común de detectar directamente las células que se preparan para dividir es mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Estos incluyen el nucleósido radioactivo analógico 3H-timidina más análogos nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2' deoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiuridina (EdU). La incorporación de EdU se detecta por química de clic, que tiene varias ventajas en comparación con BrdU. En este informe, proporcionamos un protocolo para medir la proliferación mediante la incorporación de EdU. Este protocolo incluye opciones para varias lecturas, junto con las ventajas y desventajas de cada una. También discutimos los lugares donde el protocolo se puede optimizar o modificar para satisfacer las necesidades específicas del experimento planeado. Por último, tocamos las formas en que este protocolo básico se puede modificar para medir otros metabolitos celulares.

Introducción

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La proliferación es una parte crítica de la función celular1,2. El control de la proliferación influye en procesos normales como el desarrollo y en procesos patológicos como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares. El crecimiento hiperplástico de las células musculares lisas vasculares, por ejemplo, se cree que es un precursor de la aterosclerosis3. Los cambios en la proliferación celular también se utilizan para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Dado su impacto generalizado, la medición de la proliferación es un pilar de muchos laboratorios basados en la biología celular.

La proliferación celular se puede medir simplemente contando las células si la población celular de interés se divide con bastante rapidez. Para las células de crecimiento más lento, el recuento de células puede ser menos sensible. La proliferación se mide a menudo mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Aunque el estándar de oro es la incorporación de 3H-timidina, muchos laboratorios están alejándose de este método dada la disponibilidad de alternativas más nuevas y no radiactivas. Estos incluyen colorantes fluorescentes citoplasmáticos, detección de proteínas asociadas al ciclo celular, y la incorporación de análogos de nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2' desoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiruridina (EdU)4.

Los tintes citoplásmicos, como el éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE), detectan la proliferación porque la intensidad del tinte se reduce a la mitad cada vez que la célula divide5. Esta técnica se utiliza comúnmente en la citometría de flujo para células no adherentes. No se ha utilizado mucho para células adherentes, pero con la nueva generación de lectores de placas de imágenes esto puede cambiar. La detección de proteínas asociadas al ciclo celular a través de técnicas basadas en anticuerpos (citometría de flujo, inmunohistoquímica, etc.) se utiliza a menudo para tejidos o células no adherentes. Estas células/tejidos deben ser fijados y permeabilizados antes de la tinción. Los análogos de nucleósidoBrdU y EdU son similares en enfoque a 3H-timidina, pero sin el inconveniente de la radiactividad. La incorporación de BrdU se detecta mediante anticuerpos anti-BrdU, y por lo tanto las células deben ser fijas y permeabilizadas antes de la tinción. Además, las células deben tratarse con DNase para exponer el epítopo de BrdU.

La incorporación de EdU se detecta mediante la química de clics, en la que los grupos de alquino y azida "hacen clic" juntos en presencia de cobre catalítico. Cualquiera de los grupos puede servir como molécula biosintéticamente incorporada o molécula de detección4. Los análogos de nucleósidos disponibles comercialmente tienen el grupo alquino unido. Para los ensayos de proliferación, por lo tanto, el análogo de nucleósido salyne funcionalizado es detectado por un azida conjugada con un tinte fluorescente u otro marcador. La incorporación de EdU tiene varias ventajas sobre BrdU. En primer lugar, debido a que los grupos de alquino y azida no se encuentran en las células de mamíferos, esta interacción es muy específica con un fondo bajo6. Debido a que ambos grupos son pequeños, las células no necesitan someterse a la desnaturalización del ADN para exponer el análogo de nucleósido como se requiere para BrdU7. Por último, la química del clic es muy versátil, y se puede utilizar para el etiquetado metabólico de ADN, ARN, proteínas, ácidos grasos, y carbohidratos8,9,10,11. Si el objetivo metabólicamente etiquetado de interés está en la superficie celular, las células vivas se pueden etiquetar12. Además, las células se pueden procesar para la tinción inmunofluorescente con anticuerpos.

El siguiente protocolo describe el uso de la incorporación de EdU y la química de clic para medir la proliferación en células musculares lisas vasculares humanas(Figura 1). Mostramos tres formas diferentes de medir la incorporación de EdU, resultados representativos de cada uno, y sus ventajas y desventajas. La medición de la proliferación a través de la química de clics es particularmente útil para las células de crecimiento adherente y más lentas. Además, la morfología de la célula está bien mantenida y también se puede realizar la tinción basada en anticuerpos.

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Protocolo

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1. Detección de EdU usando etiqueta fluorescente

  1. Soluciones de stock
    1. Prepare una solución de stock EdU de 5 mM añadiendo 12,5 mg de EdU a 10 ml de DobleE2O destilado.
    2. Preparar los componentes de la solución de etiquetado: 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg en 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg en 1 mL H2O; hacer fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azida (1 mg en 95,3 mL H 2 O 2 O 2 O2O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 , se almacena en alícuotas de 5 l a -20 oC) y ascorbato sódico de 1 M (200 mg en 1 ml de H2O; en fresco).
    3. Preparar la solución de stock de resazurina a una concentración de 0,15 mg/ml. Filtrar esterilizar y almacenar 1 mL alícuotas a 4oC.
      NOTA: Picolyl azida está disponible conjugada con varios fluores diferentes, biotina y peroxidasa de rábano picante (HRP).
  2. Etiquetar las células musculares lisas vasculares (VSMC) con EdU.
    NOTA: Los VSCM humanos fueron aislados de las arterias ilíacas a través del crecimiento de trozos de tejido explantados. Cuando se cultivan en medios libres de suero con insulina, transferrina, selenio estas células expresan marcadores VSMC de altilina, cadena pesada de miosina muscular lisa (SM-MHC) y SMC áactina13.
    1. Placa vascular células musculares lisas a 2 x 104/ml en el medio de eagle modificado de Dulbecco (DMEM) en una placa de 96 pozos.
      NOTA: Las células se cultivan a 37 oC en medios de células musculares lisas con un 2% de suero bovino fetal.
    2. (Opcional) Espere varias horas para pasar la noche para la adherencia. Añadir 20 l de stock de resazurina a cada poca. Incubar a 37oC durante 3 h. Leer la señal de fluorescencia en un lector de placas (560ex, 594em). Sustituya los medios por DMEM frescos.
      NOTA: Este paso es opcional. Resazurin se utiliza para normalizar los números de celda y tener en cuenta la variabilidad bien a pozo en el chapado14.
    3. Añadir solución salina tamponada de fosfato (PBS) o factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) 30 ng/mL a 3 x 6 pozos por tratamiento al comienzo del período de cultivo e incubar durante 72 h.
    4. Diluir 5 mM EdU stock a 1 mM. Añadir 2 l a cada pocal (concentración final 20 m) durante las últimas 24 h del período de cultivo de 72 h. No agregue EdU a un conjunto de réplicas. Estos pozos se utilizarán para determinar la fluorescencia/luminiscencia de fondo.
      NOTA: La duración del cultivo y etiquetado con EdU está optimizada para células musculares lisas, pero puede necesitar ser modificada por tipo de célula.
  3. Fijar celdas en paraformaldehído (PFA).
    1. Retire los medios y agregue 150 sl de 4% PFA (en PBS) por pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    2. Retire el PFA y agregue 150 l de 1% de éter de polietilenglicol tert-octilfenilo (TX-100) (en agua) por pocil durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    3. Retire TX-100 lavándolo tres veces con PBS.
      ADVERTENCIA: La PFA es tóxica, maneja con cuidado.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las celdas fijas se pueden almacenar en PBS a 4 oC.
  4. Detectar EdU incorporado.
    1. Hacer solución de etiquetado (10 ml por 96 pocillos, utilizando 60 pocillos interiores) justo antes de su uso mediante la adición de reactivos de soluciones de stock en el siguiente orden: THPTA 20 l, CuSO4 20 l, ciádula picolida de 5 ol, ascorbato de Na 100 l a PBS para un volumen total de 10 ml.
    2. Retire el PBS de los pozos y agregue 150 l de solución de etiquetado a cada poca. Incubar 30 min a 37oC. Para detectar todos los núcleos, agregue 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) a cada pocal. Leer en un lector de placas de fluorescencia (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) o imagen en un microscopio.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Las celdas fijas y teñidas se pueden almacenar en PBS a 4 oC e imágenes más adelante.

2. Detección de EdU utilizando luminiscencia

  1. Complete las secciones 1.1–1.3.
  2. Prepare la solución salina con Tris-buffered con 0.1% polisorbato 20 (TBST).
  3. Pozos de bloques.
    1. Añadir 150 l de tampón de bloqueo(Tabla de materiales)a cada pocto e incubar durante 90 minutos a temperatura ambiente.
    2. Retire el tampón de bloqueo y lávelo tres veces con 200 ml de PBS.
  4. Detectar EdU incorporado.
    1. Hacer la solución de etiquetado como se indica en el paso 1.4.1, sustituyendo la biotina picolyl azida por Ci3 picolyl azida.
    2. Lavar los pozos cinco veces con 200 ml de TBST, con agitación, 3 minutos por lavado.
    3. Peroxidasis endógenas de quench con 150 ml de 0,3% H2O2 para 20 min a temperatura ambiente.
    4. Retire H2O2 y lave cinco veces con 200 ml de TBST, agitando 3 minutos por lavado.
    5. Diluir la peroxidasa de estreptavidina-caballo de rábano (SA-HRP; 1:200) en TBST y añadir 50 l a cada pocto. Incubar 1 h a temperatura ambiente.
    6. Lavar cinco veces con 200 ml de TBST, con agitación, 3 min por lavado.
    7. Añadir 50 ml de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas quimioluminiscentes (ELISA) sustrato(Tabla de materiales)a cada pocil.
    8. Leer inmediatamente en el lector de placas capaz de detectar luminiscencia.

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Resultados

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En la Figura 2,demostramos los resultados de tres experimentos diferentes que miden la proliferación de VSMC en respuesta al PDGF. Después de cultivar las células en medios formulados para smCs, llevamos a cabo el experimento en DMEM libre de suero, para eliminar cualquier efecto potencial de los factores séricos o de crecimiento en la proliferación. En la Figura 2A comparamos los resultados, del mismo experimento, utilizando una lectura fluorescente vs luminisc...

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Discusión

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La incorporación de EdU es una forma sencilla y directa de medir la proliferación celular; es particularmente útil para las células adherentes13. Nuestro protocolo utiliza células musculares lisas, pero es aplicable a cualquier célula adherente (epitelial, endotelial, etc.). Aunque el protocolo no es complicado, el único paso crítico es hacer que la solución de etiquetado sea: los ingredientes deben agregarse en el orden indicado. Además, al igual que las manchas occidentales quimioluminiscentes, ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Katie Carroll por la asistencia técnica. También damos las gracias al Dr. David Cool y al Laboratorio de Análisis de Proteómica por la instrucción y el suministro del lector de placas de imágenes Cytation. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Estatal Wright (a L.E.W.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-etinil-2'-desoxiuridinaCarbosynthNE08701
biotina picolil azida ClickChemistry Tools1167-5
CuSO4Fisher ScientificC1297-100G
Cy3 picolyl azideClick Chemistry Tools1178-1
Lector de placas de citaciónMicroscopio Biotek
EVOSThermo Fisher Scientific
Solución de peróxido de hidrógenoSigma-Aldrich216763
Na ascorbatoSigma-Aldrich11140-250G
NucBlue Sondas listas para la tinción de celda fijaInvitrogenR37606DAPI tinción nuclear
Tampón de bloqueo OdysseyLi-Cor927-40000tampón
de bloqueoServicios demicroscopía electrónica15710
PBSFisher ScientificSH3002802
Cloruro de sodioSigma Life ScienceS3014-5kg
Estreptavidina Rábano picante Peroxidasa ConjugadoLife TechnologiesS911
Super Signal ELISA FemtoThermo ScientificPI137075Sustrato ELISA
Lector de placas Synergy Biotek
THPTAClick Chemistry Tools1010-100
Tris Clorhidrato de hidroximetilaminometano (Tris-HCl)Fisher ScientificBP153-500
Triton X 100Bio-Rad1610407
Tween 20Fisher ScientificBP337-100
de paraformaldehído

Referencias

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