Los cloroplastos son los orgánulos que definen las plantas1. Junto con muchas otras funciones metabólicas, de desarrollo y de señalización, los cloroplastos son responsables de la fotosíntesis, el proceso por el cual la energía solar se aprovecha para alimentar las actividades celulares de la vida. Por ello, los cloroplastos son esenciales, no solo para las plantas, sino también para la multitud de ecosistemas que dependen de las plantas y para la agricultura. Los cloroplastos están compuestos por miles de proteínas diferentes, la mayoría codificadas por núcleos e importadas del citosol antes de ser enviadas internamente a uno de varios compartimentos intraorgánelos claramentedistintos. Para lograr una comprensión más completa del desarrollo y funciones de los cloroplastos, y para habilitar estrategias biotecnológicas que impliquen manipulación de cloroplastos y aborden desafíos globales relacionados con la seguridad alimentaria o la bioenergía, será esencial determinar la localización, localización e interacciones de proteínas importantes de los cloroplastos. Esta colección de métodos describe un conjunto de técnicas críticamente importantes y complementarias que pueden utilizarse para lograr estos objetivos. La colección se centra principalmente en la planta modelo ampliamente utilizada Arabidopsis thaliana (berro de thale), aunque los métodos también pueden adaptarse y aplicarse a otros organismos.
La colección incluye descripciones de dos técnicas diferentes para analizar la importación de proteínas codificadas por núcleo en cloroplastos a lo largo de la doble membrana. El artículo de Ling yJarvis 2 describe un método in vitro en el que cloroplastos aislados se incuban con una proteína precursora marcada radiactivamente. El grado en que los cloroplastos absorben la proteína precursora se determina monitorizando el cambio de tamaño de la proteína que ocurre como resultado de la escisión de péptidos en tránsito (secuencia líder), utilizando SDS-PAGE e imagen con fósforo. El método presentado es un desarrollo de un enfoque que se ha utilizado para estudiar la importación de proteínas de cloroplasto in vitro durante varias décadas 3,4, e incorpora pasos adicionales que permiten evaluar la capacidad de respuesta de la maquinaria de importación a las condiciones de estrés que experimentala planta 5. Por otro lado, el artículo de Lee et al.6 describe un método in vivo basado en la expresión transitoria de una proteína precursora quimérica, que transporta un dominio proteico fluorescente, en células intactas (protoplastos). En este ensayo, el grado de importación de proteínas de cloroplasto puede seguirse de dos maneras diferentes: monitorizando la localización e intensidad de la señal de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia; y, analizando el cambio de tamaño de la proteína que ocurre como resultado de la escisión peptídica en tránsito mediante inmunobloting. Estos dos métodos son altamente complementarios y pueden ofrecer resultados convincentes cuando se usan juntos enparalelo 5.
Una vez que una proteína ha sido importada a través del envoltorio hacia el cloroplasto, y su péptido de tránsito ha sido retirado, puede adquirir su conformación final en el estroma (el principal compartimento acuoso interno del orgánulo), o activar alguna de varias vías internas de clasificación1. Como lugar de los complejos fotosintéticos altamente abundantes, las membranas tilacoides son un destino importante para este tipo de clasificación interna; De hecho, la selección de proteínas tilacoides implica múltiples vías mecánicamente distintas. El artículo de Asher et al.7 describe una serie de métodos in vitro que permiten estudiar diferentes vías de translocación de proteínas tilacoides. Estos métodos implican la incubación de tilacoides aislados con proteína precursora marcada radiactivamente y, en algunos casos, un extracto estromalo concentrado. Se monitoriza el grado en que la proteína es absorbida por los tilacoides evaluando la clivación de la señal de dirección y la protección de la proteína frente a la termolisina proteasa aplicada exógenamente, utilizando SDS-PAGE e imagen con fósforo. Por supuesto, los tilacoides no son el único subcompartimento del cloroplasto, y a menudo es deseable tener la capacidad de evaluar otros compartimentos también. En este sentido, el artículo de Bouchnak et al.8 es especialmente importante, ya que describe métodos para la subfraccionación de cloroplastos para producir muestras de alta pureza correspondientes a las membranas envolventes, el estroma y los tilacoides. Una vez preparadas, estas fracciones pueden analizarse mediante inmunoblot y/o espectrometría de masas, para proporcionar una gran cantidad de información sobre la localización suborganelar de las proteínas cloroplastas9.
En cuanto al análisis de interacciones proteína-proteína y ensamblajes de complejos multiproteicos, en la colección se describen dos metodologías diferentes. El artículo de Shanmugabalaji et al.10 presenta un método para la purificación de afinidad de complejos multiproteicos cloroplastos. Esta técnica implica el análisis de plantas transgénicas que expresan un componente del complejo de interés que ha sido diseñado para portar una etiqueta de afinidad (la llamada etiqueta de purificación de afinidad tándem, o etiqueta TAP). La capacidad de esta etiqueta para unirse fuertemente a una matriz que de otro modo es inerte se aprovecha como parte de la estrategia de purificación. El método presentado se centra específicamente en la purificación de la maquinaria de importación de proteínas de cloroplastos (esto comprende complejos multiproteicos llamados TOC y TIC incrustados en las membranasenvolventes 1), pero en principio puede adaptarse para estudiar cualquiera de los otros ensamblajes multiproteicos que existen en los cloroplastos11. El artículo de Rantala et al.12 describe un enfoque complementario para la caracterización compleja basado en la electroforesis bajo condiciones nativas. La técnica, tal como se presenta aquí, consiste en la liberación de complejos fotosintéticos a partir de tilacoides purificados usando detergente suave y no iónico, seguida de su separación con el blue native (BN)-PAGE. La resolución primaria de los complejos puede ir seguida de una segunda dimensión de electroforesis bajo condiciones de desnaturalización, lo que permite la visualización de los componentes individuales de cada complejo identificados en la primera dimensión. Al igual que con el método TAP, este enfoque nativo PAGE puede adaptarse con éxito para estudiar otros complejos proteicos dentro delorgánulo 13,14. Con cualquiera de los dos enfoques, los complejos purificados pueden analizarse de diversas maneras, incluyendo inmunoblot y espectrometría de masas.
En conjunto, los artículos incluidos en esta colección de métodos presentan un conjunto poderoso de técnicas complementarias que, en conjunto con los recursosexistentes 15,16, pueden emplearse para mejorar enormemente nuestra comprensión de diversos aspectos de la biogénesis y función de los cloroplastos, especialmente aquellos estrechamente vinculados al proteoma orgánelar. Dado que los cloroplastos son responsables de la mayor parte de la producción primaria fotosintética terrestre y, además, desempeñan un papel vital en las respuestas de las plantas al medio ambiente (incluyendo tanto estrés bióticos como abióticos), estos notables orgánulos seguirán siendo inevitablemente un foco principal de investigación fundamental y aplicada en todo el mundo durante años.