Los modelos de ratón de xenoinjerto de melanoma uveal de hígado humano ortotópico se crearon utilizando técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica con técnicas de inyección de agujas y trozos tumorales derivados del paciente con líneas celulares de melanoma uveal humano cultivadas.
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Artículo de método
Generación de una plataforma de xenoinjerto de melanoma uveal humano ortotópico hepático en ratones inmunodeficientes
En este artículo
Resumen
Resumen
En las últimas décadas, los tumores de xenoinjerto derivados del paciente o las líneas celulares humanas cultivadas se han reconocido cada vez más como modelos más representativos para estudiar los cánceres humanos en ratones inmunodeficientes que las células humanas establecidas tradicionales líneas in vitro. Recientemente, se han desarrollado modelos de xenoinjerto tumoral derivado del paciente (PDX) implantados ortotótológicamente en ratones para replicar mejor las características de los tumores de los pacientes. Se espera que un modelo de ratón de xenoinjerto ortotópico hepático sea una plataforma útil de investigación del cáncer, proporcionando información sobre la biología tumoral y la terapia farmacológica. Sin embargo, la implantación de tumores ortotópicos hepáticos es generalmente complicada. Aquí describimos nuestros protocolos para la implantación ortotópica de tumores de melanoma uveal de hígado-metastásico derivados del paciente. Cultivamos líneas celulares de melanoma uveal metastásico hepático humano en ratones inmunodeficientes. Los protocolos pueden dar lugar a tasas de éxito técnico consistentemente altas utilizando una técnica de implantación ortotópica quirúrgica con trozos de tumor de melanoma uveal derivado del paciente o una técnica de inyección de aguja con línea celular humana cultivada. También describimos protocolos para la exploración por TC para detectar tumores hepáticos interiores y para técnicas de reimplantación utilizando tumores crioconservados para lograr el reinjerto. Juntos, estos protocolos proporcionan una mejor plataforma para los modelos de ratón tumor ortotópico hepático de melanoma uveal metastásico hepático en la investigación traslacional.
Introducción
El melanoma veal es el tumor maligno intraocular más común entre los adultos en el mundo occidental. Durante los últimos 50 años, la incidencia de melanoma uveal (5,1 casos por millón) se ha mantenido estable en los Estados Unidos1,2. El melanoma veal surge de melanocitos en el iris, cuerpo ciliar o coroides, y es una enfermedad extremadamente letal cuando desarrolla metástasis. La tasa de mortalidad de los pacientes con metástasis de melanoma uveal fue del 80% a 1 año y del 92% a los 2 años después del diagnóstico inicial de las metástasis. El tiempo entre el diagnóstico de metástasis y la muerte suele ser corto, menos de 6 meses, sin tener en cuenta la terapia3,4. El cáncer se propaga a través de la sangre y tiende a hacer metástasis dominantes en el hígado (89-93%)4,5. Se necesita urgentemente un modelo de ratón eficaz para una investigación más profunda del melanoma uveal hepático-metastásico. Para la investigación traslacional, existe una clara demanda para generar un modelo de ratón de melanoma uveal metastásico localizado en el hígado.
Se espera que los modelos de ratón de xenoinjerto tumoral derivado del paciente (PDX) proporcionen estrategias de medicina individualizada. Estos modelos pueden ser predictivos de los resultados clínicos, ser útiles para la evaluación de fármacos preclínicos y ser utilizados para estudios biológicos de tumores6. Los modelos PDX representativos son ratones xenoinjertos implantados con tumores ectopáticamente, que tienen tumor en sitios subcutáneos. La mayoría de los investigadores pueden hacer cirugía para la implantación subcutánea sin práctica especial7,8. También pueden controlar los tumores subcutáneos fácilmente. Aunque los modelos PDX subcutáneos se hicieron populares en la fase de investigación, tienen algunos obstáculos para pasar a su uso práctico. La implantación subcutánea obliga a los tumores derivados del paciente a injertaren en un microambiente diferente del origen tumoral, de modo que conduce a la insuficiencia del injerto y al crecimiento lento del tumor 9,10,11, 12,13,14. El injerto ortotópico puede ser un enfoque más ideal y racional para un modelo PDX porque utiliza el mismo órgano que el tumor original15,16.
Recientemente, desarrollamos protocolos para técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica de tumores de melanoma uveal de hígado-metastásico derivados del paciente y técnicas de inyección de agujas con una línea celular de melanoma uveal hígado-metastásico humano cultivado en NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ratones17,18. Los protocolos dan como resultado tasas de éxito técnico consistentemente altas. También establecimos técnicas de tomografía computarizada que son útiles para detectar tumores hepáticos interiores, y desarrollamos la reimplantación de tumores crioconservados en la plataforma PDX. Encontramos que los modelos de xenoinjerto tumoral de melanoma uveal mantienen las características del tumor hepático del paciente original, incluyendo sus características histopatológicas y moleculares. Juntos, estas técnicas proporcionan una mejor plataforma para modelos de tumores ortotópicos hepáticos para el melanoma uveal en la investigación traslacional.
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Protocolo
Los pacientes inscritos en el estudio deben proporcionar su consentimiento por escrito que permita el uso de muestras quirúrgicas descartadas con fines de investigación y estudios genéticos, de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC).
1. Colección de tejido tumoral fresco derivado del paciente
- Obtenga tejido tumoral derivado del paciente a partir de una cirugía o una biopsia con aguja en un quirófano del hospital.
- Coloque el tejido tumoral en un recipiente de 100 ml que contenga la solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks sobre hielo.
- Transfiera el tejido a una campana estéril (nivel de bioseguridad 2) en un laboratorio.
- Continúe con el paso 2 tan pronto como sea posible.
NOTA: Por razones de seguridad, excluya a los pacientes con infecciones conocidas por VIH o Hepatitis B o C.
2. Procesamiento de tejido tumoral fresco derivado del paciente
- Coloque el tejido en un tubo de 50 ml que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre hielo. Para lavar el tejido, agregue PBS en el tubo y deseche pbS del tubo dos veces.
- Transfiera el tejido a un plato de Petri que contenga PBS en hielo.
- Usando fórceps estériles y tijeras, retire las partes necróticas del tejido. Mantenga el tejido húmedo y frío durante los pasos 2.3 a 2.5. Para muestras de biopsia con aguja, omita los pasos 2.3 y 2.5, y no corte las muestras.
NOTA: El tejido necrótico a menudo se rompe fácilmente cuando se toca. - Cortar el tejido en 1 mm3 cubos para la implantación quirúrgica del hígado.
- Cortar el resto del tejido en cubos de 2 mm en la placa Petri.
- Transfiéralos a un microtubo de 1,7 mm con un 4% de formalina para análisis histológico y a otro tubo para análisis genómico y proteómico.
- Coloque los microtubos en un frasco de nitrógeno líquido con nitrógeno líquido. Transfiera los tubos a un congelador de -80 oC para un almacenamiento permanente.
NOTA: El tiempo entre la extracción de la muestra del paciente y el procesamiento de tejidos no debe exceder los 30 min.
3. Implantación quirúrgica del hígado con tejido tumoral derivado del paciente
- Rocíe todos los objetos que entren en la capucha para una cirugía con un 70 % de alcohol etílico.
NOTA: Esto incluye instrumentos quirúrgicos, almohadillas de calentamiento y máquinas de anestesia. - Mida el peso de un hisopo de algodón y una lámina de tela.
- Anestetiza un ratón con un vaporizador de isoflurano de 3-5% colocándolo en la cámara de inducción.
- Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, colóquelo en posición supina en una almohadilla de calentamiento. Coloque el cono de isoflurano en el hocico del ratón para inhalar 1.5–3% de isoflurano para el mantenimiento de la anestesia.
NOTA: El ratón debe estar en la almohadilla de calentamiento durante todo el procedimiento. La falta de calentamiento puede causar hipotermia. - Confirme la anestesia adecuada sin reacción cuando el pie del ratón esté pinchado con fórceps ultrafinos.
- Inyectar buprenorfina (0,6 mg/kg) por vía subcutánea en el flanco utilizando una aguja de 27 G en una micro jeringa antes de la cirugía.
- Aplicar 70% alcohol etílico en el abdomen y extender el pelaje hacia arriba y hacia abajo. Después de esparcir el pelaje, confirme una visualización más fácil de la piel debajo del área subcostal izquierda para un corte más fácil. No se asepíe el pelaje del abdomen.
NOTA: El pelaje ocultará el lugar de la incisión después de la cirugía y evitará que el ratón rasque la operación posterior a la incisión. Sin embargo, puede afeitar el pelaje para prevenir la infección del sitio de la incisión de acuerdo con las normas institucionales. - Aplicar yodo y dejar que se absorba en la piel.
- Coloque una cortina quirúrgica estéril con un orificio de 2 cm en el ratón.
- Levante la piel abdominal con fórceps ultrafinos curvos y haga una incisión transversal de 1 cm de la piel subcostal izquierda con tijeras curvas.
- Inserte la punta de las tijeras curvas debajo de la piel de la incisión y ábralas ligeramente para separar el peritoneo de la piel. Retirar las tijeras de la incisión con cuchillas cerradas.
NOTA: Abrir y cerrar tijeras dentro del ratón puede causar daños y sangrado. - Localice el hígado debajo del peritoneo. Confirme un color rojizo oscuro a través del peritoneo.
- Con tijeras curvas, haga una incisión transversal de 1 cm en el peritoneo. Si una arteria peritoneal sangra desde el filo, detenga inmediatamente el sangrado con cauterio.
- Coge el tejido graso usando fórceps ultrafinos curvos con una mano, inserta el borde de un hisopo de algodón debajo del lóbulo hepático izquierdo y enrolla el hisopo hacia abajo con la otra mano para sacar el hígado.
NOTA: Agarrar tejido graso es importante para evitar que el tejido graso se pegue al hisopo de algodón. - Exteriorizar el hígado en el hisopo de algodón y colocar el hígado en una hoja de tela absorbente no tejido.
NOTA: La hoja de tela desempeña dos funciones esenciales en la estabilización del hígado y la absorción de hemorragias. - Haga una incisión de 5 mm de ancho y profundidad usando una cuchilla estéril de bisturí No. 11 para formar un bolsillo en el parénquima mientras presiona suavemente el sitio de la incisión con el hisopo de algodón.
- Inserte la cuchilla en paralelo con la superficie del hígado y corte horizontalmente.
- Presione el sitio de la incisión con el hisopo de algodón para detener cualquier hemorragia.
NOTA: No mantenga la hoja vertical, de lo contrario romperá a través del hígado y lesione grandes vasos en el medio del hígado.
- Enrolle el hisopo de algodón hacia arriba para abrir el sitio de la incisión e implante un cubo de 1 mmy 3 de tejido tumoral en el bolsillo con fórceps ultrafinos curvos. Retraiga los fórceps mientras rueda el hisopo de algodón en rotación inversa y presione hacia abajo.
NOTA: Presionar hacia abajo en el sitio de la incisión con el hisopo de algodón mientras se retrae los fórceps ayuda a prevenir el desplazamiento del tumor dentro del bolsillo. - Retire suavemente el hisopo de algodón del lugar de la incisión después de la implantación. Continúe con el paso 3.19 tan pronto como sea posible.
- Ponga un hemostat absorbible en el sitio de la incisión.
- Confirma la hemostasis. Si el sangrado continúa, agregue más hemostat en el sitio de la incisión.
- Pelar el hígado de la hoja de tela con fórceps (preferiblemente contundentes) y poner el hígado de nuevo en la cavidad abdominal.
- Peritoneo de sutura con doble ligadura usando 5-0 sutura absorbible.
- Sutura la piel con triple ligadura usando 5-0 sutura absorbible.
NOTA: La triple ligadura ayuda a prevenir la dehiscencia de la incisión quirúrgica. - Observe el ratón hasta que esté completamente despierto y vuelva a colocarlo en la jaula.
- Mida el peso del hisopo de algodón y la hoja de tela con sangre para el volumen de sangrado durante la cirugía. Compárelos con sus pesos originales antes de la cirugía. Reduzca el sangrado durante la cirugía a menos del 10% del volumen sanguíneo circulante en el ratón.
4. Recolección y Procesamiento de Hígado Humano Cultivado Metastásico Línea Celular de Melanoma Uveal
- Preparar células cultivadas.
- Recopile celdas y calcule el número de celda utilizando un contador de celdas.
- Prepare una cantidad apropiada de suspensión celular para 10.0 x 106 células en un tubo de 15 ml.
- Gire el tubo a 300 x g durante 5 minutos en una centrífuga a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante en el tubo de 15 ml. Deje el gránulo celular en la parte inferior del tubo.
- Añadir 50 l de medio RPMI 1640 en un tubo de 1,7 ml.
- Cortar la punta de una punta de 200 l con tijeras para agrandar la abertura de la punta.
- Añadir 60 ml de matriz de membrana de sótano utilizando una pipeta con la punta cortada en el tubo de 1,7 ml que tiene RPMI.
- Mezclar RPMI y matriz en el tubo de 1,7 ml. Vórticelo.
- Añadir 110 l de la mezcla en el pellet celular en el tubo de 15 ml. Transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de 1,7 ml.
- Mantenga el tubo en hielo antes de la inyección de la aguja.
5. Implantación quirúrgica de agujas de hígado humano cultivado línea celular de melanoma uveal metastásico en el hígado
- Siga el protocolo antedicho de los pasos 3.1 a 3.15.
- Recoja la suspensión celular con una microjeringa con una aguja de 27 G.
- Inserte la aguja a lo largo de la superficie del hígado y avance la punta de la aguja 5 mm más profundo.
- Inyectar 20 oL de suspensión celular en el hígado.
- Cauterizar el punto de inserción del hígado para evitar que las células inyectadas se escapen. Confirma la hemostasis.
- Siga el protocolo antedicho de los pasos 3.21 a 3.24.
6. Tomografía computarizada
- Coloque el ratón en un restrainer en estado despierto.
- Limpie la cola con una almohadilla de alcohol estéril para la desinfección y vasodilatación.
- Inyectar 100 ml de agente de contraste de TC a través de la vena de la cola con una aguja de 27 G en una jeringa de 1 ml.
- Espere 4 horas después de la inyección antes de tomar la tomografía computarizada.
NOTA: Toma 4 h hasta que el agente es tomado por células del hígado Kupffer. - Cuatro horas después de la inyección, anestesia el ratón portador del tumor con isoflurano vaporizado entre un 3 y un 5% colocándolo en la cámara de inducción.
- Una vez que el ratón esté completamente anestesiado, colóquelo en la posición propensa en una tomografía computarizada.
- Confirme la anestesia adecuada sin reacción cuando el pie del ratón esté pinchado con fórceps ultrafinos.
- Realice una tomografía computarizada durante 15 minutos.
- Asegúrese de que el ratón se despierte por completo después de la tomografía computarizada y vuelva a colocarlo en la jaula.
- Evaluar la existencia de tumor y medir el tamaño del tumor en las imágenes de TC.
NOTA: El agente de contraste mejora el parénquima hepático normal para que sea fácil reconocer el tumor no mejorado. No malinterprete la vesícula biliar y el estómago como tumor.
7. Cosecha y procesamiento de tejido
- Euthanizar ratones usando CO2 seguido de dislocación cervical colocando el dedo índice y el pulgar detrás del cráneo y tirando del cuerpo por la base de la cola. Continúe con el paso 7.2 tan pronto como sea posible.
- Coloque el ratón en posición supina y rocíe el abdomen con un 70% de alcohol etílico.
- Use fórceps estériles y tijeras estériles para hacer una incisión transversal de 3 cm debajo del proceso de xifoide para exponer los órganos abdominales.
- Intuye el tejido tumoral y realice los pasos 2.1 a 2.2.
- Corta el resto del tumor en cubos de 2 mm en la placa Petri.
- Transferirlos a un tubo criogénico con criomedium para su reimplantación después de la criopreservación.
- Coloque los tubos en un recipiente de congelación criogénico lleno de isopropanol.
- Transfiera el recipiente a un congelador de -80 oC para un almacenamiento temporal. No coloque los criotubos con criomedium directamente en un tanque de nitrógeno líquido. Congele lentamente a una velocidad de enfriamiento de -1 oC/min para preservar el tejido tumoral.
- Al día siguiente, transfiera los tubos a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento permanente.
8. Reimplantación
- Mantenga los tubos congelados en un frasco de nitrógeno líquido con nitrógeno líquido hasta que esté listo para implantar el tejido. Minimizar la exposición del tejido a la temperatura ambiente para mantener la viabilidad y aumentar las posibilidades de injerto.
- Descongelar el tubo crioconservado en un baño de agua a 37 oC.
- Realice los pasos 2.2–2.4.
- Implante el tumor descongelado en ratones como se describe en los pasos 3.1–3.24.
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Resultados
La implantación ortotópica quirúrgica mediante el método de bolsillo hepático puede trasplantar el tumor de melanoma uveal metastásico hepático humano en el hígado del ratón con una alta tasa de éxito del 80% en un plazo de seis meses. El tumor de xenoinjerto se injerta en el hígado como un tumor solitario sin nódulos de la hija(Figura 1 y Figura 3A). La técnica de inyección ortotópica quirúrgica en el hígado utilizando microaguj...
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Discusión
Los modelos de xenoinjerto ortotópicos actuales son intensivos en mano de obra, requieren mucho tiempo y son costosos de crear. Modelos de ratón xenoinjerto tumoral para el cáncer de hígado se establecieron hace más de dos décadas19,20,21. Sin embargo, esta técnica es complicada y requiere el uso de equipos especiales, como un soporte de microagujas y de 6-0 a 8-0 suturas finas bajo un microscopio. El tumor y el tejido hepático ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Estamos agradecidos a M. Ohara, K. Saito y M. Terai, por revisar el manuscrito. Los autores reconocen la crítica para la asistencia editorial y en inglés de este manuscrito por el Dr. R. Sato en Fox Chase Cancer Center. El trabajo descrito aquí fue apoyado por el Bonnie Kroll Research Fund, el Mark Weinzierl Research Fund, el Eye Melanoma Research Fund en La Universidad Thomas Jefferson, the Osaka Community Foundation y JSPS KAKENHI Grant Number JP 18K15596 en Osaka City Universidad. Los estudios en el laboratorio del Dr. A. Aplin fueron apoyados por la subvención de NIH R01 GM067893. Este proyecto también fue financiado por un Dean's Transformative Science Award, un Premio de la Iniciativa Programática de la Universidad Thomas Jefferson.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales, tejidos y animales | |||
| Buprenorfina | |||
| CO2 tanque | |||
| Cryomedium | |||
| Exitron nano 12000 (Agente de contraste de nanopartículas a base de metales alcalinotérreos) | Miltenyl Biotec | 130-095-700 | |
| HBSS 1x, con calcio & magnesio | Corning | 21-020-CM | |
| celular de melanoma uveal metastásico hepático humano | |||
| Tejido de melanoma uveal humano en el hígado | Toda la manipulación de tejidos debe realizarse en una capucha de nivel de bioseguridad 2. Tenga cuidado al trabajar con tejido humano; Utilice siempre guantes y evite el contacto directo con la piel. Supongamos que los pacientes pueden haber sido infectados con el VIH u otros organismos altamente transmisibles. No procese muestras que se sabe que son portadoras de infecciones. | ||
| Isoflurano de yodo | |||
| Productos Purdue | 67618-150-17 | ||
| Isopropanol | Fisher scientific | A416-1 | Evite el contacto directo con la piel y los ojos y la inhalación de agentes anestésicos. |
| Nitrógeno | |||
| Matrigel HC | BD | 354248 | |
| NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | ratones Jackson Lab | 5557 | 4 a 8 semanas |
| de edad 1x, sin calcio ni magnesio | Corning | 21-031-CM | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-013-CV | |
| Almohadilla de preparación con alcohol estéril (70% de alcohol isopropílico) | Productos Nice-Pak | B603 | |
| Solución tampón de fosfato de paraformaldehído al 4% | Wako | 163-20145 | |
| Solución de alcohol etílico al 70% | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| >Equipments | |||
| Hemostático absorbible | Johnson and Johnson | 63713-0019-61 | |
| Autoclave | |||
| Medida | |||
| Cauterio | Bovie Medical | MC-23009 | |
| Contador | |||
| Centrífuga | |||
| Contenedor de congelación criogénica | NALGENE | 5100-0001 | |
| Cryotube | SARSTEDT | 72.379 | |
| Tijeras curvas | World Precision Instruments | 503247 | |
| Pinzas ultrafinas curvas | World Precision Instruments | 501302 | |
| Lámina | |||
| Congelador | |||
| Bote de filtro F/AIR | Harvard Apparatus 600979 | ||
| Almohadilla | |||
| Vaporizador de isoflurano | Artisan Scientific | 66317-1 | |
| Nitrógeno | |||
| Tarro de nitrógeno líquido | Thermo Fisher Scientific | 2123 | |
| Micro-CT scan | Siemens | ||
| Portaagujas | World Precision Instruments | 501246 | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Pipeta | |||
| Frasco | |||
| Campana estéril Armario | bioseguridad de nivel 2 | ||
| Bisturí estéril n.º 11 | AD Surgical | A300-11-0 | |
| Pinza recta | World Precision Instruments | 14226 | |
| Paño | |||
| Sujetador de venas de cola | Braintree Scientific | TV-150-STD | |
| Baño | |||
| Jeringa TB de 1 mL con aguja de 27 G | BD | 309623 | |
| tubo de 1,7 mL | Bioexpress | C-3260-1 | |
| 5-0 PDO Sutura | AD Surgical | S-D518R13 | |
| 15 mL tubos cónicos | AZER SCIENTIFIC | ES-9152N | |
| Aguja de 27 G | BD | 780301 | |
| Aguja de 27 G | Hamilton | 7803-01 | |
| Tubos cónicos de 50 mL | AZER SCIENTIFIC | ES-9502N | |
| 50 µ L micro jeringa | BD | 80630 | |
| 50 µ L micro jeringa | Hamilton | 7655-01 | |
| Contenedor de 100 mL | Fisher Scientific | 12594997 | |
| 200μ Punta en L |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
