Artículo de método

Un ensayo robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X mental retardado-1

DOI:

10.3791/59963

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16 de septiembre de 2019

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1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Un ensayo preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X de retraso mental-1 facilita el diagnóstico molecular y el cribado del síndrome de X frágil y las repeticiones X frágiles trastornos con menor tiempo de respuesta e inversión en equipos.

Resumen

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El síndrome X frágil (FXS) y los trastornos asociados son causados por la expansión de la repetición de trinucleótido de citosina-guanina-guanina (CGG) en la región no traducida (UTR) de 5' del promotor del gen Frágil X de retardación mental-1 (FMR1). Convencionalmente, el análisis de fragmentos de electroforesis capilar en un analizador genético se utiliza para el dimensionamiento de las repeticiones CGG de FMR1,pero se requiere un análisis adicional de la mancha sureña para la medición exacta cuando el número de repetición es superior a 200. Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación por PCR de las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 utilizando un kit de PCR X Frágil, seguido de la purificación de los productos pcR y el tamaño de los fragmentos en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y interpretación posterior del número de repeticiones de CGG haciendo referencia a normas con repeticiones conocidas utilizando el software de análisis. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar toda la gama de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1, incluidos aquellos con un número repetido de más de 200 (clasificados como mutación completa), 55 a 200 (premutación), 46 a 54 (intermedio) y 10 a 45 (normal). Es un método rentable que facilita la clasificación de los trastornos asociados al FXS y X frágiles con robustez y tiempo de notificación rápido.

Introducción

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Los trastornos asociados al síndrome De X frágil (FXS) y X frágil, por ejemplo, el síndrome de temblor y ataxia (FX-TAS), y la insuficiencia ovárica primaria (FX-POI) son causados principalmente por la expansión de repetición de trinucleótidos de citosina-guanina-guanina (CGG) en los 5' no traducidos (UTR) del gen de retardo mental X frágil-1 (FMR1) en Xq27.31,2. La proteína codificada FMR1 (FMRP) es una proteína de unión al ARN asociada al polisistores que funciona en el desarrollo neuronal y la plasticidad sináptica regulando el empalme alternativo, la estabilidad y el transporte dendrítico....

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Protocolo

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La aprobación ética fue otorgada por el Comité de ética de la investigación clínica del clúster oriental de la Universidad China Conjunta de Hong Kong-Nuevos Territorios (Número de referencia: 2013.055)

1. Amplificación de PCR

  1. Antes de comenzar, retire la mezcla tampón de PCR, el diluyente de muestras y las muestras de ADN (tanto el ADN de prueba como el de referencia) (ver la Tabla de Materiales)del congelador de -20 oC y manténgalos a temperatura ambiente durante 20-30 minutos para asegurarse de que todos los reactivos y el ADN estén completamente descongelados. Vórtice y gire brevemente antes de su uso.
    2. <....

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Resultados

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Los resultados de tamaño de la muestra de referencia femenina de premutación (NA20240, tamaños de repetición de 30 y 80) y la muestra de referencia femenina de mutación completa (NA20239, tamaños de repetición de 20 y 200) se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B,respectivamente. Normalmente, dos picos de marcador (marcador inferior 50 pares base [bp] y marcador superior 10.380 bp) se incluyen en el perfil de tamaño de fragmento. Por lo general, hay un pico co.......

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Discusión

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FXS es la segunda causa más común de deterioro intelectual después de la trisomía 21, que representa casi la mitad del retraso mental ligado al X30, que puede afectar aproximadamente a 1 de cada 4.000 hombres y 1 de cada 8.000 mujeres. Más importante aún, casi 1 de cada 250–1.000 hembras lleva una premutación, y esta frecuencia es 1 en 250-1.600 en los machos26,31,32,33........

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Proyecto de Manejo de Emergencias de la NSFC (Grant No. 81741004), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81860272), el Plan de Investigación Principal de la Fundación Provincial de Ciencia y Tecnología de Guangxi ( Concesión No. AB16380219), la Beca de la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (Concesión No. 2018M630993) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (Concesión No. 2018GXNSFAA281067).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrumento Bioanalizador Agilent 2100: Tubos de PCR de 0,2 mlAxygenPCR-02D-C
Instrumento Bioanalizador Agilent 2100: 1x Tampón TE, pH 8,0, libre de ARNasaAmbionAM9849
Instrumento Bioanalizador Agilent 2100: Instrumento Bioanalizador 2100AgilentG2939AA
Agilent 2100 Instrumento Bioanalizador: Placa PCR de 96 pocillosThermo FisherAB0800
Instrumento Agilent 2100 Bioanalyzer: Cartucho de electrodosAgilentSuministra el equipo del instrumento 2100 Bioanayzer
Agilent 2100 Instrumento Bioanalyzer: Mezclador de vórtice IKAAgilentSuministra el equipo del instrumento 2100 Bioanayzer
Agilent 2100 Instrumento Bioanalyzer: Software de dimensionamiento 2100 Software expertoAgilentSuministra el equipo del instrumento 2100 Bioanayzer
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Chips de pruebaAgilentSuministra el equipo del instrumento 2100 Bioanayzer
Agilent DNA 7500 kit Agilent5067-1506Para el dimensionamiento de fragmentos
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (tapa amarilla)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Marcadores DNA 7500 (tapa verde)Kit AgilentIn: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: chips de ADNKit AgilentIn: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Vial de matriz de gel de ADN (tapa roja)Kit AgilentIn: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Limpiador de electrodosAgilent Kit AgilentIn: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)
Kit Agilent DNA 7500: Filtrogiratorio Suministros de Agilent DNA 7500 kit (número de catálogo: 5067-1506)
JeringaAgilentSuministros de Agilent DNA 7500 kit (número de catálogo: 5067-1506)
Estación de cebado de virutasAgilent5065-4401Suministra equipo del instrumento 2100 Bioanayzer
Cubee MinicentrífugaGeneReachaqbd-i
Placa de filtro de vacío Colector: MultiScreenHTS Colector de vacío MerckMilliporeMSVMHTS00Instrumento de vacío para Vacío de placa filtrante Colector para la purificación de productos PCR
Vacío de placa filtrante Colector: Tapón de siliconaMerck MilliporeXX2004718Vacío de placa filtrante Colector
Vacío de placa filtrante Colector: Bomba de vacíoMerck MilliporeWP6122050Vacío de placa filtrante Colector
Colector de vacío de placa filtrante Colector: Recipiente de recogida de residuosMerck MilliporeXX1004705Colector de vacío de placa de filtro
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010para amplificación de PCR
Kit Agilent DNA 7500: DNA Dye Concentrate (tapa azul)Kit Agilent In: Kit Agilent DNA 7500 (número de catálogo: 5067-1506)Kit Agilent DNA 7500:

Referencias

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  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al.

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