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Research Article
Laurine Marger1, Antonio Barone2, Carla P. Martinelli-Kläy3, Leandra Schaub1, Malin Strasding4, Mustapha Mekki1, Irena Sailer4, Susanne S Scherrer1, Stéphane Durual1
1Division of Fixed Prosthodontics and Biomaterials, Biomaterials Laboratory,University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Division of Oral and Maxillofacial Surgery (HUG), Unity of Oral Surgery and Implantology,University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, 3Department of Surgery, Division of Oral and Maxillofacial surgery (HUG), Laboratory of Oral & Maxillofacial Pathology,University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, 4Division of Fixed Prosthodontics and Biomaterials,University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Aquí presentamos un protocolo quirúrgico en conejos con el objetivo de evaluar materiales de sustitución ósea en términos de capacidades de regeneración ósea. Mediante el uso de cilindros PEEK fijados en cráneos de conejo, osteoconducción, osteoinducción, osteogénesis y vasculogénesis inducidas por los materiales pueden evaluarse ya sea en animales vivos o eutanasiados.
El principio básico del modelo calvarial de conejo es cultivar nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Este modelo permite la evaluación de materiales de sustitución ósea para la regeneración ósea oral y craneofacial en términos de crecimiento óseo y apoyo de neovascularización. Una vez que los animales son anestesiados y ventilados (intubación endotraqueal), cuatro cilindros de cetona de éter de poliéter (PEEK) se atornillan sobre el cráneo, a ambos lados de la mediana y coronal suturas. Se perforan cinco agujeros intramedulares dentro del área ósea delimitada por cada cilindro, lo que permite la afluencia de células de médula ósea. Las muestras de material se colocan en los cilindros que luego se cierran. Finalmente, se sutura el sitio quirúrgico, y los animales se despiertan. El crecimiento óseo puede evaluarse en animales vivos mediante microtomografía. Una vez que los animales son eutanasiados, el crecimiento óseo y la neovascularización pueden evaluarse mediante microtomografía, inmunohistología e inmunofluorescencia. Como la evaluación de un material requiere la máxima estandarización y calibración, el modelo calvarial parece ideal. El acceso es muy fácil, la calibración y la estandarización se facilitan mediante el uso de cilindros definidos y se pueden evaluar cuatro muestras simultáneamente. Además, se puede utilizar una tomografía viva y, en última instancia, se puede prever una gran disminución de animales a eutanasiar.
El modelo calvarial de aumento óseo fue desarrollado en los años 90 con el objetivo de optimizar el concepto de regeneración ósea guiada (GBR) en el dominio quirúrgico oral y craneofacial. El principio básico de este modelo es cultivar nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Para ello, un reactor (por ejemplo, titanio -dome, -cilindro o -jaula) se fija en el cráneo para proteger la regeneración ósea llevada a cabo por un injerto (por ejemplo, hidrogel, sustituto óseo, etc.). Con la ayuda de este modelo, jaulas de titanio o cerámica1,2,3,4,5,6, membranas GBR7,8,9 ,10, factores osteogénicos11,12,13,14,15,16,17, hueso nuevo suplentes12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 o el mecanismo de neovascularización durante el proceso de regeneración ósea30 se evaluaron.
Desde un punto de vista traslacional, el modelo calvarial representa un defecto de una pared que se puede comparar con un defecto de clase IV en la mandíbula31. El objetivo es cultivar hueso nuevo por encima de una zona cortical, sin ningún apoyo lateral de las paredes óseas endógenas. Por lo tanto, el modelo es extremadamente estricto y evalúa el potencial real de la osteoconducción vertical sobre la parte cortical del hueso. Si el modelo descrito en el presente documento se dedica principalmente a la evaluación de la osteoconducción en sustitutos óseos, también se puede evaluar la osteogénesis y/o la osteoinducción, así como la vasculogénesis1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
Esencialmente por razones éticas, prácticas y económicas, el modelo calvarial fue desarrollado en el conejo en el que el metabolismo óseo y la estructura son bastante relevantes en comparación conel humano 32. De las 30 referencias citadas anteriormente, el 80% utilizó el conejo calvarial modelo1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, demostrando así la relevancia de este modelo animal. En 2008, el grupo Busenlechner transfirió el modelo calvarial al cerdo, para permitir la comparación de ocho sustitutos óseos simultáneamente20 (en comparación con dos sustitutos óseos con el conejo). Por otro lado, nuestro grupo transfirió el modelo calvarial de conejo a las ovejas. En resumen, las cúpulas de titanio se colocaron en cráneos de oveja para caracterizar la osteoconducción de un nuevo sustituto óseo impreso en 3D. Estos estudios nos permitieron desarrollar y dominar el modelo calvarial y su análisis16,21.
Los tres últimos estudios citaron16,20,21, junto con varias otras investigaciones12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, confirmó el gran potencial del modelo calvarial como cribado y caracterización Modelo. Sin embargo, a pesar de que los resultados obtenidos fueron bastante satisfactorios, también señalaron algunas limitaciones: (1) El uso de cúpulas de titanio, que impidieron la difusión de rayos X y a su vez el uso vivo de micro-CT. Estos no pudieron ser eliminados antes del procesamiento histológico, obligando a los investigadores a incrustar las muestras en resina de poli(metilmetacrilato) (PMMA). Por lo tanto, los análisis resultantes se limitaron en gran medida a la topografía. (2) Altos costos financieros, especialmente debido al costo de los animales, y los costos relacionados con la logística, el mantenimiento y la cirugía de los animales. (3) Dificultades para obtener aprobaciones éticas para animales grandes.
26 mejoró en gran medida el modelo del conejo. Las cúpulas de titanio fueron reemplazadas por cilindros closables que podían llenarse con un volumen constante de material. Cuatro de estos cilindros fueron colocados en cráneos de conejo. Al finalizar, los cilindros podían retirarse para que las biopsias estuvieran libres de metales, introduciendo mucha más flexibilidad en cuanto al procesamiento de muestras. El modelo calvarial de conejo se volvió atractivo para pruebas simultáneas con menores costos, fácil manejo de animales y facilitación del procesamiento de muestras. Aprovechando estos desarrollos recientes, hemos mejorado aún más el modelo reemplazando el titanio por PEEK para producir cilindros, permitiendo así la difusión de rayos X y el uso de microtomografía en animales vivos.
En este artículo, describiremos los procesos de anestesia y cirugía y mostraremos ejemplos de salidas que se pueden obtener utilizando este protocolo, es decir, histología (inmuno), histomorfometría, microtomografía en vivo y ex vivo para evaluar los mecanismos del hueso regeneración y cuantificar la nueva síntesis ósea apoyada por materiales sustitutivos óseos.
De conformidad con los requisitos legales suizos, el protocolo fue aprobado por un comité académico y supervisado por las agencias veterinarias cantonales y federales (autorizaciones no GE/165/16 y GE/100/18).
1. Dispositivos y animales específicos
2. Cirugía
3. Tratamiento postquirúrgico
El modelo descrito en este documento está dedicado a la evaluación de la osteoconducción en sustitutos óseos. También se puede evaluar la osteogénesis y la osteoinducción de los sustitutos óseos (pre-)celularizados o cargados con moléculas bioactivas, así como la vasculogénesis1,2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. Se puede utilizar un estudio cinético, desde 3 días hasta 3 meses después de la cirugía dependiendo de los mecanismos y salidas a analizar. Una línea de tiempo clásica que permite descripciones en la madrugada y media es: 2, 4, 6, 8 y 12 semanas. Tenga en cuenta que un mínimo de 6 muestras por punto de tiempo es obligatorio para obtener resultados significativos. Cada muestra a ser probada debe colocarse al menos una vez en cada posición en el cráneo por punto de tiempo (asignación aleatoria). Por último, las muestras falsas (por ejemplo, cilindros llenos de sangre coagulada) deben incluirse en el protocolo34.
Una vez completada la cirugía, el crecimiento óseo puede ser monitoreado en diferentes momentos mediante el uso de tomografía ósea en animales vivos. Un ejemplo se muestra en la Figura 4A,B. Un análisis adicional requiere que los animales sean sacrificados (inyección intravenosa letal de 150 mg/kg de pentobarbital (100 mg/ml). Después de la eutanasia, las muestras se seccionan y los cilindros se retiran cuidadosamente (Figura5). Las biopsias se fijan con una solución de solución salina tamponada con fosfato y un 4% de formaldehuro. El crecimiento óseo puede evaluarse mediante microtomografía (Figura4 C,D). Las muestras también se pueden procesar para la tinción histológica (inmune). El análisis histomorfométrico y las tinciones específicas son posibles para completar el análisis más específicamente (Figura6).

Figura 1: Especificaciones de los cilindros PEEK. Se perforaron dos orificios (0,8 mm de diámetro) en las pestañas estabilizadoras laterales para atornillar. Las posiciones de los 5 agujeros intramedulares (0,8 mm de diámetro) que se perforarán en el cráneo dentro del área delimitada por el cilindro se marcan con círculos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imagen representativa del cráneo del conejo y colocación de los cilindros. Imágenes que muestran la mediana y coronal suturas en el cráneo del conejo descongranando los huesos parietales y frontales izquierdo-derecho (A,B). Colocación de los cilindros a ambos lados de las suturas (C). Barras de escala de 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imagen representativa de los cilindros fijos, llenados y tapados. Imagen que muestra cuatro cilindros fijados en el cráneo de un conejo con tornillos de titanio. Dentro del área delimitada por cada cilindro, se perforaron 5 orificios intramedulares (0,8 mm de diámetro, 1 mm de profundidad) bajo riego con una fresa redonda para permitir la migración de células óseas. Los cilindros se llenaron con diferentes muestras sustitutivas óseas (volúmenes calibrados) antes del taponamiento (solo se muestra un cilindro cerrado). Barra de escala de 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes representativas del análisis microtomográfico (micro-CT). Con el objetivo final de evaluar el crecimiento óseo realizado por sustitutos óseos, 4 cilindros se fijaron en un cráneo de conejo con tornillos de titanio y se llenaron con materiales sustitutivos de hueso. (A) Imágenes en vivo: escaneo transversal bidimensional (14 min, 99 kV/88 a a con una resolución de 20 m) de un cilindro a las 12 semanas. (B) reconstrucción tridimensional (3D) a partir del análisis micro-CT vivo a las 4 semanas (círculos rojos: sustitutos óseos en cilindros; flecha roja: control en el que el cilindro está lleno de sangre coagulada). (C,D) Después de la eutanasia (12 semanas), los cilindros se retiraron antes de la fijación y el análisis de micro-CT. (C) Escaneo transversal 2D (57 min, 99 kV/88 áA con una resolución de 10 m) de un cilindro y reconstrucción 3D del hueso nuevo total en el cilindro (D). Se muestran partículas sustitutivas óseas (rojas), hueso nuevo (verde) y lecho óseo (amarillo). Barras de escala de 2 mm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Imágenes representativas de una biopsia a las 4 semanas. Después de la eutanasia (4 semanas), las muestras fueron seccionadas por bloques y los cilindros fueron retirados antes de la fijación en 4% de formalina, análisis de micro-CT y procesamiento histológico. Barra de escala de 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imágenes representativas de las secciones (inmunes) histológicas. Con el objetivo final de evaluar el crecimiento óseo y la neovascularización llevada a cabo por sustitutos óseos, 4 cilindros se fijaron en un cráneo de conejo con tornillos de titanio y se llenaron con sustitutos óseos. Después de la eutanasia (12 semanas), los cilindros se retiraron antes de la fijación y el procesamiento histológico. (A) Tinción Masson-Goldner (50x): sustituto óseo aparece como partículas malva rodeadas de hueso nuevo en verde. (B) Las rodajas fueron escaneadas y procesadas para la extracción digital de material sustitutivo óseo para que el nuevo hueso (rojo) pudiera cuantificarse fácilmente. (C) Inmunomanchación de CD31 (flechas), un marcador típico de células endoteliales y el proceso de neovascularización. (D) Tinción inmunofluorescente (verde) de una zona altamente neovascularizada en la que algunos capilares nuevos expresan altamente CD31 (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los autores no tienen nada que revelar.
Aquí presentamos un protocolo quirúrgico en conejos con el objetivo de evaluar materiales de sustitución ósea en términos de capacidades de regeneración ósea. Mediante el uso de cilindros PEEK fijados en cráneos de conejo, osteoconducción, osteoinducción, osteogénesis y vasculogénesis inducidas por los materiales pueden evaluarse ya sea en animales vivos o eutanasiados.
Los autores están en deuda con Geistlich AG (Wolhusen, CH) y la fundación Osteología (Lucerne, CH) (concesión no 18-049) por su apoyo, así como Con El Global D (Brignais, FR) para el suministro de los tornillos. Un agradecimiento particular va a dr. B. Schaefer de Geistlich. También estamos agradecidos a Eliane Dubois y Claire Herrmann por su excelente procesamiento histológico y sus valiosos consejos. Por último, reconocemos calurosamente a Xavier Belin, Sylvie Roulet y a todo el equipo de Pr Walid Habre, "cirugía experimental Dpt", por su notable asistencia técnica.
| Enrofloxacina Baytril 10% | Bayer | Antibiótico | |
| Fentanilo | Bischel | Para analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamina para anestesia | |
| Lidohex | Bichsel | Gel lubricante para los ojos | |
| Opsite | Smith y Sobrino | 66004978 | Apósito en aerosol |
| Povidona yodada 10%, Betadine | Mundipharma | agente antiinfeccioso | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | Para anestesia |
| Rapidocaína 2% | sintetica Anestesia | local | |
| Ringer-acetato | Fresenius Kabi | Compensación de volumen | |
| Rompun 2% | Bayer | Xilacina para anestesia | |
| Sevoflurano 5% | Abbvie | Para anestesia | |
| Solución salina estéril | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Clorhidrato de buprenorfina, analgesia | |
| Tiopental Inresa | Ospediala | Para anestesia | |
| Xilocaína 10% spray | Astra Zeneca | Para intubación | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo | |||
| Fresenius Vial piloto C | Bomba de infusión | Imexmed | |
| Almohadilla calefactada | Aparato | ||
| de HarvardAspiración dominante 50 | Medela | ||
| Tubo de aspiración Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Motor quirúrgico | Schick dental | Qube | Perforación de orificios intramedulares |
| Ventilación | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Número de catálogo | |
| Cilindros y tapones | Boutyplast | Composición personalizada | : PEEK (poliéter éter cetona) |
| Manual eje de retención | GlobalD | ACT1K | |
| Mango móvil para eje de retención automático | GlobalD | MTM | |
| Autoperforante tornillos | GlobalD | VA1.2KL4 | tornillos de accionamiento transversal compuestos por titanio grado 5, ISO 5832-3 |
| Name | >Company | Número de catálogo | >Comentarios |
| >Bandeja quirúrgica | |||
| Tubo endotraqueal Shiley diámetro 2,5mm | Covidien | 86233 | Para intubación |
| Tubo endotraqueal Shiley diámetro 4,9mm | Covidien | 107-35G | Para intubación |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Pinza de sutura no reabsorbible |
| Marcel | Blanc | BD027R | 145 mm |
| Catéter de intubación | Cook medical | Guía para la intubación | |
| Soporte de aguja | Marcel Blanc | BM008R | |
| Agujas BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Fresas quirúrgicas redondas | Patterson | 78000 | 0,8 mm de diámetro, Perforación de agujeros intramedulares |
| Bisturí | Swann-Morton | n° 10 y n° 15 | |
| Tijeras | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Jeringas Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml y 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix seguridad para el oído iv line |