Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

Muchos estudios en hematología e inmunología se basan en la disponibilidad de ratones modificados genéticamente, incluyendo ratones transgénicos/knock-out convencionales y condicionales que utilizan controladores Cre específicos del sistema hematopoyético como Mx1-Cre, Vav-Cre, y otros ^1,2,3,4,5. Estas estrategias requieren el establecimiento de nuevas cepas de ratón, que pueden ser lentas y económicamente pesadas. Si bien los avances revolucionarios en la tecnología de edición del genoma han permitido la generación de nuevas cepas de ratón en tan solo 3-4 meses con la experiencia técnica adecuada^6,7,8,9 , se requiere mucho más tiempo para amplificar la colonia de ratones antes de que se lleven a cabo los experimentos. Además, estos procedimientos son costosos. Por ejemplo, Jackson Laboratory enumera el precio actual de los servicios de generación de ratones noqueados en $16,845 por cepa (a diciembre de 2018). Por lo tanto, los métodos que son más económicos y eficientes que los enfoques transgénicos murinos convencionales son más ventajosos.

La tecnología de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente interesmadas/proteína asociada CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) ha llevado al desarrollo de nuevas herramientas para la edición rápida y eficiente del genoma específico de la secuencia basada en ARN. Originalmente descubierto como un mecanismo inmune adaptativo bacteriano para destruir el ADN patógeno invasor, el sistema CRISPR/Cas9 se ha utilizado como una herramienta para aumentar la eficacia de la edición del genoma en células eucariotas y modelos animales. Se han empleado varios enfoques para transmitir maquinaria CRISPR/Cas9 a células madre hematopoyéticas (es decir, electroporación, nucleofección, lipofección, parto viral y otros).

Aquí, se emplea un sistema de lentivirus para transducir las células debido a su capacidad para infectar eficazmente las células madre hematopoyéticas murinas que expresan Cas9 y empaquetar la construcción guía de la expresión de ARN, promotores, secuencias reguladoras y genes que codifican proteínas fluorescentes (es decir, GFP, RFP). Usando este método, se ha logrado la edición genética ex vivo de células madre hematopoyéticas de ratón, seguida de una reconstitución exitosa de la médula ósea en ratones irradiados letalmente^10. El vector de lentivirus empleado para este estudio expresa los genes reporteros Cas9 y GFP del promotor de EF1a de núcleo común con un sitio de entrada ribosomal interno aguas arriba del gen del reportero. La secuencia de ARN guía se expresa desde un promotor U6 separado. Este sistema se utiliza entonces para crear mutaciones de inserción y eliminación en los genes conductores de hematopoyesis clonal candidatas Tet2 y Dnmt3a¹⁰. Sin embargo, la eficiencia de transducción por este método es relativamente baja (-5%-10%) debido al gran tamaño de la plaquita vectorial (13 Kbps) que limita la eficiencia de transducción y reduce el ticter del virus durante la producción.

En otros estudios, se ha demostrado que un mayor tamaño de ARN viral afecta negativamente tanto a la producción de virus como a la eficiencia de transducción. Por ejemplo, se ha informado de un aumento de 1 kb en el tamaño de la plaquita para disminuir la producción de virus en un 50 %, y la eficiencia de transducción disminuirá a más del 50 % en las células madre hematopoyéticas del ratón¹¹. Por lo tanto, es ventajoso reducir el tamaño del inserto viral tanto como sea posible para mejorar la eficiencia del sistema.

Esta deficiencia puede superarse empleando ratones transgénicos Cas9, en los que la proteína Cas9 se expresa de manera constitutiva o inductible¹². Los constitutivos ratones knock-in CRISPR/Cas9 expresan la endonucleasa Cas9 y el EGFP del promotor CAG en el locus Rosa26 de una manera omnipresente. Por lo tanto, una construcción con sgRNA bajo el control del gen promotor U6 y reportero RFP bajo el control del promotor central EF1a puede ser entregada usando el vector lentivirus para lograr la edición del genoma. Con este sistema, los genes de las células madre hematopoyéticas han sido editados con éxito, mostrando una eficiencia de transducción del 90%. Por lo tanto, este protocolo proporciona un método rápido y eficaz para crear ratones en los que se introducen mutaciones genéticas dirigidas en el sistema hematopoyético. Mientras que nuestro laboratorio está utilizando predominantemente este tipo de tecnología para estudiar el papel de la hematopoyesis clonal en los procesos de enfermedades cardiovasculares^13,14,15, también es aplicable a los estudios de hematológico neoplasia maligna¹⁶. Además, este protocolo puede extenderse al análisis de cómo las mutaciones de ADN en HSPC afectan a otras enfermedades o procesos de desarrollo en el sistema hematopoyético.

Para establecer un sistema de vectores de lentivirus robusto, se requieren existencias virales de alta titer y condiciones optimizadas para la transducción y el trasplante de células hematopoyéticas. En el protocolo, se proporcionan instrucciones sobre la preparación de un stock viral de alto títer en la sección 1, optimizando las condiciones de cultivo de las células madre hematopoyéticas murinas en la sección 2, los métodos para el trasplante de médula ósea en la sección 3, y la evaluación de las injerto en la sección 4.

Todos los procedimientos relacionados con sujetos de animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Virginia.

1. Generación y purificación de partículas de lentivirus

NOTA: Las partículas de Lentivirus que contienen el ARN guía optimizado pueden ser producidas por los protocolos detallados proporcionados por Addgene: . Los métodos optimizados para la preparación y almacenamiento de lentivirus de alto valor se discuten en otros lugares^17,18. En resumen, los lentivirus se producen mediante la co-transfección de un plásmido vectorial de lentivirus, psPAX2 y pMD2.G en células HEK 293T. El sobrenadante de cultivo se recoge a 48 h después de la transfección y se concentra por ultracentrifugación. El titador lentiviral está determinado por un ensayo basado en qPCR disponible comercialmente. Este procedimiento debe realizarse en un armario de bioseguridad clase II.

1. Preparar una solución de colágeno 1:200 (0.0005%) en 1x PBS.
2. Recubrir una placa de 6 pocillos con solución de colágeno e incubar a 37oC, 5%_CO2 durante 30 min.
3. Semilla 293T células a una densidad de 1 x 10⁶ células por pozo e incubar a 37 oC, 5% CO₂ para 2 h.
4. Para preparar la mezcla de tres plásmidos de transfección para un pozo, combine 0,9 g de vector de lentivirus, 0,6 g de psPAX2 y 0,3 g de pMD2.G, luego alcance un volumen total de 10 s l añadiendo agua desionizada. Ajuste las cantidades en consecuencia dependiendo del número de pozos. Es posible que sea necesario optimizar aún más la cantidad y la proporción de cada plásmido para adaptarse a las necesidades de los investigadores.
5. Añadir con cuidado 50 ml de 1x PBS y 5 l del PEI MAX diluido (1,0 mg/ml) a la mezcla de plásmido e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT)(Tabla 1).
6. Añadir 1 ml de DMEM a la mezcla.
7. Aspirar los medios de la placa de 6 pozos, añadir 1 ml de mezcla de plásmido, e incubar a 37 oC, 5% CO₂ durante 3 h.
8. Sustituya el soporte por 2 ml de DMEM fresco e incubar a 37oC, 5%_CO2 durante 24 h.
9. Añadir 1 mL de DMEM fresco e incubar a 37oC, 5%_CO2 por 24 h adicionales (el tiempo total de incubación es de 48 h).
10. Transfiera el sobrenadante de cultivo a un tubo de 50 ml y centrífuga a 3.000 x g durante 15 minutos para eliminar las células flotantes.
11. Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 m.
12. Transfiera el filtrado a tubos centrífugos de polipropileno.
13. Ultracentrifugar a 4oC y 72.100 x g a r_máx. durante 3 h.
14. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando atrás el pellet blanco.
15. Resuspende el pellet con 100 ml de medio de expansión de células hematopoyéticas sin suero sin aireación.
16. Mantener una alícuota de 10 l para medir el rumbo viral y almacenar todas las alícuotas restantes a -80 oC hasta que sea necesario.
17. Valorar el virus con un ensayo basado en qPCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando la alícuota viral de 10 L.

2. Aislamiento y transducción de células negativas al linaje de la médula ósea del ratón(Figura 1A)

NOTA: Por lo general, para aislar suficientes células, se cosechan pares de tibias, fémures y humeri de cada ratón. Los huesos pélvico y espinal también se pueden cosechar como una fuente de células negativas al linaje.

1. Aislamiento de células de médula ósea
   1. Euthanize 8-10 semanas macho CRISPR/Cas9 knock-in ratones por 5% de isoflurano seguido de luxación cervical, luego desinfectar su piel con 70% de etanol.
   2. Usando tijeras discortezantes, haz una incisión transversal en la piel justo debajo de la caja torácica y pela la piel discada en ambas direcciones para exponer las piernas y los brazos.
   3. Separe cuidadosamente las extremidades inferiores del hueso de la cadera dislocando la articulación de la cadera. Corte a lo largo de la cabeza del fémur para eliminar el fémur completamente de la cadera. Disloque la rodilla y corte en la articulación para separar el fémur y la tibia, manteniendo intacta la epífisis ósea. Disloque la articulación del tobillo y despegue el pie y el músculo extra.
   4. Usando tijeras dislindantes, corta sobre el hombro para separar las extremidades superiores. Disloque el hombro, luego corte en la articulación del codo para cosechar el hueso del húmero.
   5. Use toallitas de fibra de celulosa para eliminar cuidadosamente los músculos de los fémures, tibias y humeri. Tome precauciones adicionales para asegurarse de que los huesos no se rompan durante este proceso.
   6. Coloque los huesos aislados en un tubo cónico de 50 ml que contenga RPMI y colóquelos sobre hielo.
      NOTA: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo en un armario de clase II de bioseguridad.
   7. Transfiera los huesos a un plato de cultivo estéril de 100 mm.
   8. Agarre el hueso con fórceps contundentes y, usando tijeras disincrustadoras, corte cuidadosamente ambas epífisis.
      NOTA: Un corte insuficiente conducirá a un lavado incompleto de la médula ósea, mientras que el corte demasiado agresivo resultará en la pérdida de células.
   9. Llene una jeringa de 10 ml con RPMI helada, y con una aguja de 22 G, enjuague la médula ósea del eje en un nuevo plato de cultivo de 100 mm.
      NOTA: Los huesos se volverán blancos y translúcidos si el eje óseo ha sido bien enrojecido. Si no es así, vuelva a cortar los extremos del hueso y vuelva a lancarlo.
   10. Después de recoger toda la médula ósea, haga una suspensión de una sola célula pasando la médula ósea varias veces a través de una jeringa de 10 ml con una aguja de 18 G. Repita 10x para asegurar una suspensión de una sola célula.
   11. Filtrar la suspensión celular a través de un colador de células de 70 m en un tubo cónico de 50 ml.
   12. Centrífuga a 310 x g durante 10 min a 4oC.
   13. Aspirar el sobrenadante y resuspender los pellets celulares en un volumen adecuado de búfer de separación optimizado para el siguiente proceso de separación celular.
2. Aislamiento y transducción de lentivirus de células negativas al linaje
   NOTA: Las células negativas al linaje del ratón se aíslan de la médula ósea de los ratones transgénicos Cas9^3,u otras cepas de ratones, utilizando un kit de agotamiento del linaje de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Típicamente, las células negativas al linaje representan entre el 2% y el 5% de las células nucleadas de la médula ósea entera, y la pureza suele ser superior al 90% después del aislamiento. Las células negativas de linaje aisladas se cultivan en un medio de expansión de células hematopoyéticas sin suero complementado con TPO murino recombinante de 20 ng/ml y SCF murino recombinante de 50 ng/ml, luego transducido con el vector de lentivirus durante 16 h a una multiplicidad de (MOI) a 100.
   1. Para aislar las células negativas del linaje, utilice el kit de agotamiento de la célula de linaje de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Después del aislamiento, resuspenda las células negativas al linaje en 1 ml de medio de expansión de células hematopoyéticas sin suero.
   3. Sembrar las células en una placa de 6 pozos a una densidad de 1,5 x 10⁶ celdas/ml (5 x 10⁵ celdas negativas de linaje/ratón.)
   4. Añadir TPO murino recombinante y SCF en pozos a concentraciones finales de 20 ng/ml y 50 ng/mL, respectivamente.
   5. Preincubar células a 37oC en 5%_CO2 durante 2 h.
   6. Añadir el lentivirus a MOI a 100, 4 g/ml de polibreno y penicilina/estreptomicina a los pozos e incubar a 37oC, 5%_CO2 para 16-20 h(Figura 1B).
   7. Al día siguiente, recoger las células transducidas por lentivirus en un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 300 g durante 10 min.
   8. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 l de RPMI por ratón. Mantenga las células en RT hasta que se transcriban en ratones (sección 3).

3. Trasplante de células transducidas en ratones irradiados letalmente

1. El día del trasplante de médula ósea, coloque los ratones receptores en una jaula de ocho rebanadas y expongalos a dos dosis de irradiación de todo el cuerpo (550 Rad/dosis, dosis total de 1100 Rad), con aproximadamente 4 horas entre cada sesión de irradiación.
2. Después de la segunda sesión de irradiación, inyectar células negativas de linaje transducido a cada ratón receptor anestesiado a través del plexo de vena retroorbital (200 l en total) utilizando una jeringa de insulina(Figura 1C).
3. Después de la irradiación, los ratones deben ser alojados en jaulas esterilizadas y provistos de una dieta blanda y agua potable suplementada con antibióticos durante 14 d.
4. A las 3-4 semanas después del trasplante de médula ósea, analice la sangre periférica para comprobar si hay injerto de células de donantes transducidas (sección 4).

4. Evaluar el chimerismo de la sangre periférica

1. Anestetizar ratones con 5% de isoflurano y obtener una muestra de sangre de una vena retro-orbital utilizando tubos capilares, y recogerlo en tubos K₂EDTA (el volumen en un tubo capilar es suficiente para el siguiente ensayo).
2. Transfiera 20 ml de sangre de los tubos K2EDTA a los tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml y colóquelo en hielo.
3. Añadir 1,5 ml de tampón de lisis RBC a los glóbulos rojos de la lyse. Incubar durante 5 minutos sobre hielo.
4. Para neutralizar el tampón de lisis, lave las muestras con el tampón FACS (1,5 ml/muestra).
5. Centrífuga a 609 x g a r_máx. durante 5 min a 4oC. Descarta el sobrenadante.
6. Incubar las células con un cóctel de anticuerpos monoclonales (diluidos en 100 l de tampón/muestra FACS) a RT durante 20 minutos en la oscuridad. Se proporciona una lista completa de anticuerpos en la sección Materiales anterior.
7. Lave las células una vez con el búfer FACS (2 mL/muestra). Centrífuga a 609 x g a r_máx (1.800 rpm) durante 5 min a 4oC. Deseche el sobrenadante por completo.
8. Fijar las celdas con paraformaldehído que contiene tampón de fijación (100 l/tubo) durante 10 minutos a 4 oC.
9. Lave las células una vez con el búfer FACS (3 ml/muestra). Centrífuga a 609 x g a r_máx (1.800 rpm) durante 5 min a 4oC. Deseche el sobrenadante por completo.
10. Suspenda el pellet en 400 l de búfer FACS.
11. Mantener las muestras a 4 oC hasta el análisis por citometría de flujo.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se han obtenido aproximadamente 0.8-1.0 x 108 células de médula ósea por ratón. El número de celdas negativas de linaje que obtenemos es de aproximadamente 3 x 106 celdas por ratón. Típicamente, el rendimiento de las células negativas del linaje de la médula ósea es del 4%-5% del total de las células nucleares de la médula ósea.

El chimerismo de las células transducidas (RFP-positivo) se evalúa mediante citometría de flujo de la sangre periférica(Figura 2A,B). La sangre se aísla de la vena retroorbital y se utilizan marcadores apropiados para determinar la identidad de cada población celular hematopoyética (es decir, neutrófilos, monocitos, células T, etc.) (Figura 3A,B). El ADN genómico se puede aislar de las células sanguíneas positivas para RFP, y las secciones del ADN del sitio objetivo pueden ser amplificadas por PCR y subclonadas en vectores de clonación TA para el análisis de secuencia. Estos plásmidos son transducidos a E. coli y las secuencias del sitio de destino se determinan mediante la secuenciación de Sanger(Figura 4). Alternativamente, las secuencias de sitios de destino se pueden determinar mediante otros métodos, como la secuenciación de Sanger del genoma agrupado seguido de un seguimiento de las indels mediante el análisis de descomposición (TIDE)10. Para la condición de control, los ratones suelen ser trasplantados con células que se transduplanden con un lentivirus que expresa ARN guía no objetivo.

Figura 1: Ilustración esquemática de este protocolo. (A) Aislamiento de células de médula ósea negativas al linaje de ratones que expresan Cas9 (sección 2.1). (B) Transducción lentivirus de células negativas al linaje (sección 2.2). (C) Inyección retro-orbital de células transducidas en ratones de tipo salvaje irradiados letalmente (sección 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Transducción lentiviral eficiente de células negativas de linaje de médula ósea de ratón in vitro. (A) El análisis de citometría de flujo revela una transducción exitosa de células negativas al linaje. El análisis se realizó después de 7 días de cultivo in vitro. (B) En promedio, el 75,7% de las células fueron transducidas en este ensayo (n.o 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3:Reconstitución de médula ósea deratón irradiada letalmente por células negativas de linaje transducido. (A) Análisis de citometría de flujo de sangre periférica del ratón tras la reconstitución por células madre hematopoyéticas que fueron (abajo) o no fueron transducidas con lentivirus que expresan RFP. Los neutrófilos se definen como Ly6G+ y Ly6Chi monocitos como Ly6G- y Ly6C+, y células B como CD45R+. (B) En estos ensayos, un promedio del 94,8%, 93,5% y 82,7% de las células son RFP+ en las poblaciones de neutrófilos,himonocitos Ly6C y células B, respectivamente (n.o 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 4:Evaluación de laedición génica en células sanguíneas transducidas. (A) Ejemplo de edición genética que muestra los resultados de secuenciación del locus Mutado De Dnmt3a en células sanguíneas positivas para RPF. Las eliminaciones se muestran como guiones rojos y las inserciones se indican con letras rojas. (B) Resumen de las mutaciones detectadas. (C) El 69% (11/16 clones) mostraron mutaciones de parada prematuras/fuera de trama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Tabla 1: Cantidades de plásmido y PEI-max utilizadas para la transfección.

Los autores no tienen nada que revelar.