Rata automatizada de un solo pellet alcanzando la reconstrucción tridimensional de trayectorias de patas y dígitos

Resumen

El alcance con habilidades de roedores se utiliza comúnmente para estudiar habilidades hábiles, pero requiere mucho tiempo y esfuerzo para implementar la tarea y analizar el comportamiento. Describimos una versión automatizada del alcance cualificado con seguimiento de movimiento y reconstrucción tridimensional de trayectorias de alcance.

Resumen

El alcance con habilidades de roedores se utiliza comúnmente para estudiar habilidades hábiles, pero requiere mucho tiempo y esfuerzo para implementar la tarea y analizar el comportamiento. Recientemente se han desarrollado varias versiones automatizadas de alcance cualificado. Aquí, describimos una versión que presenta automáticamente pellets a ratas mientras graba vídeo de alta definición desde múltiples ángulos a altas velocidades de fotogramas (300 fps). La pata y los dígitos individuales se rastrean con DeepLabCut, un algoritmo de aprendizaje automático para la estimación de la pose sin marcadores. Este sistema también se puede sincronizar con grabaciones fisiológicas, o ser utilizado para desencadenar intervenciones fisiológicas (por ejemplo, estimulación eléctrica u óptica).

Introducción

Los humanos dependen en gran medida de la habilidad dietuta, definida como movimientos que requieren movimientos multi-articulares y digitales coordinados con precisión. Estas habilidades se ven afectadas por una serie de patologías comunes del sistema nervioso central, incluyendo lesiones estructurales (por ejemplo, accidente cerebrovascular, tumor, lesiones desmielinantes), enfermedad neurodegenerativa (por ejemplo, enfermedad de Parkinson) y anomalías funcionales circuitos (por ejemplo, distonía). Entender cómo se aprenden e implementan las habilidades hábiles por los circuitos motores centrales tiene, por lo tanto, el potencial de mejorar la calidad de vida de una gran población. Además, es probable que esta comprensión mejore el rendimiento motor en personas sanas optimizando las estrategias de capacitación y rehabilitación.

Disecijar los circuitos neuronales subyacentes a la habilidad hábil en los seres humanos está limitado por consideraciones tecnológicas y éticas, lo que requiere el uso de modelos animales. Los primates no humanos se utilizan comúnmente para estudiar movimientos de extremidades hábiles dada la similitud de sus sistemas motores y repertorio conductual con los seres humanos¹. Sin embargo, los primates no humanos son caros con largos tiempos de generación, lo que limita el número de sujetos de estudio y las intervenciones genéticas. Además, mientras que la caja de herramientas neurocientífica aplicable a los primates no humanos es más grande que para los seres humanos, muchos avances tecnológicos recientes no están disponibles o están significativamente limitados en los primates.

El alcance experto de los roedores es un enfoque complementario para estudiar el control del motor diestro. Las ratas y los ratones pueden ser entrenados para alcanzar, agarrar y recuperar un pellet de azúcar en una secuencia estereotipada de movimientos homólogos a los patrones de alcance humano². Debido a su tiempo de generación relativamente corto y menores costos de vivienda, así como su capacidad para adquirir alcances calificados durante días o semanas, es posible estudiar un gran número de asignaturas durante las fases de aprendizaje y consolidación de habilidades. El uso de roedores, especialmente ratones, también facilita el uso de potentes herramientas neurocientíficas modernas (por ejemplo, optogenética, imágenes de calcio, modelos genéticos de la enfermedad) para estudiar la habilidad hábil.

El alcance experto de los roedores se ha utilizado durante décadas para estudiar el control motornormal y cómo se ve afectado por patologías específicas como el accidente cerebrovascular y la enfermedad de Parkinson 3. Sin embargo, la mayoría de las versiones de esta tarea son laboristas y de mucho tiempo, mitigando los beneficios del estudio de los roedores. Las implementaciones típicas implican la colocación de roedores en una cámara de alcance con un estante delante de una ranura estrecha a través de la cual el roedor debe alcanzar. Un investigador coloca manualmente los pellets de azúcar en el estante, espera a que el animal llegue, y luego coloca otro. Los alcances se puntúan como éxitos o fracasos, ya sea en tiempo real o por revisión de vídeo⁴. Sin embargo, simplemente la puntuación alcanza los éxitos o los fracasos ignora los datos cinemáticos enriquecidos que pueden proporcionar información sobre cómo (en lugar de simplemente si) el alcance se ve afectado. Este problema se solucionó mediante la implementación de una revisión detallada de los vídeos de acceso para identificar y puntuar semicuantitativamente los submovimientos⁵. Si bien esto añadió algunos datos sobre la cinemática de alcance, también aumentó significativamente el tiempo y el esfuerzo del experimentador. Además, los altos niveles de participación de los experimentadores pueden conducir a incoherencias en la metodología y el análisis de datos, incluso dentro del mismo laboratorio.

Más recientemente, se han desarrollado varias versiones automatizadas de alcance cualificado. Algunos se adhieren a la jaula doméstica^6,7, eliminando la necesidad de transferir animales. Esto reduce el estrés en los animales y elimina la necesidad de aclimatarlos a una cámara de alcance especializada. Otras versiones permiten el seguimiento de la pata para que los cambios cinemáticos bajo intervenciones específicas se puedan estudiar^8,9,10, o tener mecanismos para determinar automáticamente si los pellets fueron arrancados de la plataforma¹¹. Las tareas automatizadas de alcance cualificado son especialmente útiles para el entrenamiento de alta intensidad, como puede ser necesario para la rehabilitación después de una lesión^12. Los sistemas automatizados permiten a los animales realizar un gran número de alcances durante largos períodos de tiempo sin necesidad de una participación intensiva de los investigadores. Además, los sistemas que permiten el seguimiento de la pata y la puntuación automatizada de los resultados reducen el tiempo dedicado al investigador a realizar el análisis de datos.

Desarrollamos un sistema automatizado de alcance experto en ratas con varias características especializadas. En primer lugar, mediante el uso de un pedestal móvil para llevar el pellet a "posición de alcance" desde abajo, obtenemos una vista casi sin obstáculos de la extremidad delantera. En segundo lugar, un sistema de espejos permite múltiples vistas simultáneas del alcance con una sola cámara, permitiendo la reconstrucción tridimensional (3-D) de las trayectorias de alcance utilizando una cámara de alta resolución y alta velocidad (300 fps). Con el reciente desarrollo de algoritmos de aprendizaje automático robustos para el seguimiento de movimiento sin marcadores^13,ahora rastreamos no sólo la pata, sino los nudillos individuales para extraer el alcance detallado y la cinemática de agarre. En tercer lugar, un frame-grabber que realiza un procesamiento de vídeo simple permite la identificación en tiempo real de distintas fases de alcance. Esta información se utiliza para desencadenar la adquisición de vídeo (la adquisición continua de vídeo no es práctica debido al tamaño del archivo), y también se puede utilizar para desencadenar intervenciones (por ejemplo, optogenética) en momentos precisos. Por último, los fotogramas de vídeo individuales son activados por pulsos de lógica transistor-transistor (TTL), lo que permite que el vídeo se sincronice con precisión con grabaciones neuronales (por ejemplo, electrofisiología o fotometría). Aquí, describimos cómo construir este sistema, entrenar ratas para realizar la tarea, sincronizar el aparato con sistemas externos y reconstruir trayectorias de alcance 3D.

Protocolo

Todos los métodos relacionados con el uso animal descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Michigan.

1. Configuración de la cámara de alcance

NOTA: 14 para obtener detalles y diagramas del aparato. Los números de pieza se refieren a la Figura 1.

1. Unir paneles de policarbonato transparente con cemento acrílico para construir la cámara de alcance (15 cm de ancho por 40 cm de largo por 40 cm de alto) (parte #1). Un panel lateral (parte #2) tiene una puerta con bisagras (18 cm de ancho por 15 cm de alto) con una cerradura. Si la rata se atará a un cable, corte una hendidura (5 cm de ancho por 36 cm de largo) en el techo de la cámara para acomodarla (parte #12). El panel de suelo tiene 18 orificios (1,75 cm de diámetro) (parte #13) cortados en él y no está unido al resto de la cámara.
2. Montar y alinear sensores infrarrojos (parte #3) en los paneles laterales a 4,5 cm de la parte posterior de la cámara y 3,8 cm del suelo. El software de comportamiento tiene un indicador ('IR Back') que es verde cuando el haz infrarrojo está intacto y rojo cuando el haz está roto. Una vez que se configura el software, esto se puede utilizar para comprobar la alineación del sensor.
3. Monte un espejo (15 cm x 5 cm, parte #4) 10 cm por encima de la ranura de alcance (parte #14). Angulo el espejo para que la varilla de entrega de pellets sea visible para la cámara.
4. Coloque la cámara sobre una caja de soporte sanitizable (59 cm de ancho por 67,3 cm de largo por 30,5 cm de alto, parte #5). La cámara descansa por encima de un agujero en la caja de soporte (12 cm de ancho por 25 cm de largo) que permite que la basura caiga a través de los orificios del suelo (parte #13) y fuera de la cámara de reaching. Cortar un segundo agujero (7 cm de ancho por 6 cm de largo, parte #15) en la caja de soporte delante de la ranura de alcance, lo que permite que una varilla de entrega de pellets para llevar pellets a la ranura de alcance.
5. Montar dos espejos (8,5 cm de ancho x 18,5 cm de alto, parte #6) en el suelo con imanes a cada lado de la cámara para que el borde largo del espejo toque el panel lateral a 3 cm de la parte delantera de la caja que llega. Angulo los espejos para que la cámara pueda ver en la caja y el área delante de la ranura de alcance donde se entregará el pellet.
6. Monte la cámara de alta definición (parte #7) a 17 cm de la ranura de alcance, frente a la caja.
7. Monte papel negro (parte #18) a ambos lados de la cámara para que el fondo de los espejos laterales esté oscuro. Esto mejora el contraste para mejorar la detección de patas en tiempo real y fuera de línea.
8. Montar el actuador lineal (parte #16) en un marco sanitizable (25 cm de ancho por 55 cm de largo por 24 cm de alto, parte #8) con tornillos. El actuador está montado boca abajo para evitar que el polvo de pellets se acumule dentro de su potenciómetro de sensor de posición.
9. Inserte una placa tórica de espuma en el cuello del depósito de pellets (embudo) (parte #9) para evitar que se acumule polvo en el conjunto. Monte el embudo debajo de un agujero (6 cm de diámetro, parte #17) en la parte superior del marco deslizando los bordes del embudo por encima de tres tornillos perforados en la parte inferior de la parte superior del marco. Inserte el tubo guía (#10 de piezas) en el cuello del embudo.
10. Fije el conector T de plástico al extremo de la varilla de acero del actuador. Inserte el extremo cónico de la varilla de entrega de pellets en la parte superior del conector y el extremo tapado a través del tubo guía en el depósito de pellets.
11. Coloque el conjunto del actuador lineal debajo de la cámara de alcance hábil para que la varilla de entrega de pellets pueda extenderse a través del orificio (parte #15) delante de la ranura de alcance.
12. Coloque todo el aparato de alcance en un armario con ruedas (121 cm x 119 cm x 50 cm) ventilado con ventiladores de computadora (el interior se calienta cuando está bien iluminado) y forrado con espuma acústica.
13. Construir cinco paneles de luz (parte #11) mediante la adhering tiras de luz LED en paneles de soporte de 20,3 cm por 25,4 cm. Monte la película difusora sobre las tiras de luz. Monte un panel de luz en el techo sobre el área de la varilla de entrega de pellets. Monte los otros cuatro en los lados de los armarios a lo largo de la cámara de alcance.
    NOTA: Es importante iluminar el área alrededor de la ranura de acceso y la varilla de entrega de pellets para la identificación de la pata en tiempo real.

2. Configuración del ordenador y el hardware

1. Instale el agarrador de marcos FPGA y las tarjetas de extensión digital según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Recomendamos al menos 16 GB de RAM y un disco duro de estado sólido interno para el almacenamiento de datos, ya que la transmisión de vídeo de alta velocidad requiere una capacidad de almacenamiento en búfer significativa.
2. Instale los controladores para la cámara de alta definición y conéctelo al framegrabber FPGA. El software de comportamiento debe estar en ejecución e interactuando con la cámara para utilizar el software asociado con la cámara.
   NOTA: El código incluido (ver archivos complementarios) accede a los registros programables en la cámara y puede que no sea compatible con otras marcas. Recomendamos grabar al menos 300 fotogramas por segundo (fps); a 150 fps encontramos que los cambios clave en la postura de la pata a menudo se echaban de menos.
3. Copie el código incluido (proyecto) en "SR Automation_dig_ext_card_64bit" en el equipo.

3. Entrenamiento conductual

1. Prepare ratas antes del entrenamiento.
   1. House Long-Evans ratas (hombres o hembras, de 10 a 20 semanas) en grupos de 2-3 por jaula en un ciclo de luz/oscuridad inversa. Tres días antes del entrenamiento, coloque a las ratas en la restricción de alimentos para mantener el peso corporal 10-20% por debajo del nivel basal.
   2. Manipule ratas durante varios minutos al día durante al menos 5 días. Después de manipular, coloque 4-5 pellets de azúcar por rata en cada jaula doméstica para introducir el nuevo alimento.
2. Habituar la rata a la cámara de alcance (1-3 días)
   1. Encienda las luces LED y coloque 3 pellets de azúcar en la parte delantera y trasera de la cámara.
   2. Coloque la rata en la cámara y deje que la rata explore durante 15 minutos. Repita esta fase hasta que la rata se coma todos los pellets del suelo.
   3. Limpie la cámara con etanol entre ratas.
      NOTA: Realice entrenamientos y pruebas durante la fase oscura. Entrena a las ratas a la misma hora todos los días.
3. Entrena a la rata para que alcance y observe la preferencia de la pata (1–3 días).
   1. Encienda las luces y coloque la rata en la hábil cámara de acceso.
   2. Usando fórceps, sostenga un pellet a través de la ranura de alcance en la parte delantera de la caja (Figura1, Figura 2). Deje que la rata coma 3 perdigones de los fórceps.
   3. La próxima vez que la rata intente comer el pellet de los fórceps, tire del pellet hacia atrás. Eventualmente, la rata intentará alcanzar el pellet con su pata.
   4. Repita esto 11 veces. La pata que la rata utiliza más de los 11 intentos es la "preferencia de pata" de la rata.
      NOTA: Un intento se define como la pata que se extiende más allá de la ranura de alcance. La rata no necesita obtener y comer con éxito el pellet.
4. Entrenar a la rata para llegar a la barra de entrega de pellets (1-3 días)
   1. Alinee la varilla de entrega de pellets con el lado de la ranura que llega contralateral a la pata preferida de la rata (utilice una guía para asegurar una colocación consistente a 1,5 cm de la parte delantera de la cámara de alcance). La parte superior de la varilla de entrega debe alinearse con la parte inferior de la ranura de alcance (Figura2B). Coloque un pellet en la varilla de entrega.
      NOTA: Colocar la barra de entrega frente a la pata preferida de la rata dificulta que la rata obtenga el pellet con su pata no preferida. No hemos tenido problemas con ratas usando su pata no preferida. Sin embargo, en ciertos modelos (por ejemplo, accidente cerebrovascular) esto todavía puede ocurrir y se puede agregar una restricción en la extremidad de alcance no preferida.
   2. Cebo la rata con un pellet sostenido usando fórceps, pero dirigir la rata hacia la barra de entrega para que su pata golpee el pellet en la varilla. Si la rata saca el pellet de la varilla, reemplácelo. Algunas ratas pueden no llegar inicialmente lo suficientemente lejos. En este caso, mueva la barra de entrega de pellets más cerca de la ranura de alcance y luego muévala lentamente más lejos a medida que la rata mejora.
   3. Después de unos 5-15 cebo llega la rata comenzará a alcanzar el pellet en la barra de entrega espontáneamente. Una vez que la rata ha intentado 10 llega a la barra de entrega sin ser cebado, puede avanzar a la siguiente fase.
5. Entrena a la rata para solicitar un pellet (2-8 días).
   NOTA: Aunque hemos tenido ratas de entrenamiento 100% de éxito para alcanzar pellets, alrededor del 10% de las ratas no aprenden a solicitar un pellet moviéndose a la parte posterior de la cámara.
   1. Coloque la varilla de entrega de pellets en función de la preferencia de la pata de la rata y establézcala en la posición 2 (Figura2A). Ajuste las posiciones de altura de la barra de entrega de pellets utilizando el mando a distancia del actuador. Manteniendo pulsados los botones 1 y 2 simultáneamente mueve la barra de entrega hacia arriba, mientras que manteniendo presionados los botones 3 y 2 mueve la barra de entrega hacia abajo. Cuando la barra de entrega esté a la altura correcta, mantenga pulsado el número deseado hasta que la luz parpadee en rojo para ajustarla.
   2. Coloque la rata en la cámara y cebón la rata a la parte posterior con un pellet. Cuando la rata se mueva lo suficientemente lejos a la parte posterior de la cámara que rompería el haz infrarrojo si la versión automatizada se estaba ejecutando, mueva la barra de entrega de pellets a la posición 3 (Figura2B).
   3. Espere a que la rata alcance el pellet y luego mueva la varilla de entrega de pellets de nuevo a la posición 2 (Figura2A). Coloque un nuevo pellet en la barra de entrega si fue derribado.
   4. Repita estos pasos, cebando gradualmente la rata cada vez menos, hasta que la rata comience a: (i) moverse hacia atrás para solicitar un pellet sin ser cebado, y (ii) inmediatamente pasar al frente después de solicitar un pellet en la parte posterior. Una vez que la rata ha hecho esto 10 veces, está listo para el entrenamiento en la tarea automatizada.

4. Entrenamiento de ratas utilizando el sistema automatizado

1. Configure el sistema automatizado.
   1. Encienda las luces de la cámara y rellene el depósito de pellets si es necesario.
   2. Coloque la varilla de entrega de pellets de acuerdo con la preferencia de la pata de la rata. Compruebe que las posiciones del actuador están configuradas correctamente (como en la Figura 2A).
   3. Encienda el ordenador y abra el programa Skilled Reaching (SR_dig_extension_card_64bit_(HOST)_3.vi). Introduzca el número de identificación de rata en Asunto y seleccione la preferencia de pata en el menú desplegable Mano. Especifique la ruta de guardado para los vídeos.
   4. Establezca Tiempo de sesión y Vídeos máximos (número de vídeos en los que finalizar la sesión). El programa dejará de ejecutarse en el límite que se alcance primero.
   5. Establezca la duración de la elevación del pellet (duración del tiempo que la varilla de entrega permanece en la posición "3" después de que la rata solicite un pellet). Activar o desactivar la penalización de alcance anticipado (la barra de entrega se restablece a la posición "1" y luego de nuevo a "2" si la rata llega antes de solicitar un pellet).
2. Tome imágenes de calibración. La reconstrucción de trayectoria 3D utiliza una caja de herramientas de visión artificial para determinar las matrices de transformación adecuadas, lo que requiere identificar los puntos coincidentes en cada vista. Para ello, utilice un cubo pequeño con patrones de tablero de ajedrez en cada lado (Figura3).
   1. Coloque la mano de ayuda dentro de la cámara de alcance y empuje el clip del caimán a través de la ranura de alcance. Sostenga el cubo delante de la ranura de acceso con el clip de cocodrilo.
   2. Coloque el cubo de modo que el lado rojo aparezca en el espejo superior, el lado verde en el espejo izquierdo y el lado azul en el espejo derecho. Toda la cara de cada uno de los tres lados debe ser visible en los espejos (Figura3).
   3. En el programa de comportamiento, asegúrese de que El Umbral de ROI esté establecido en un valor muy grande (por ejemplo, 60000). Haga clic en el botón Ejecutar (flecha blanca). Una vez que el botón Camera Initialized se vuelva verde, pulse START. Tenga en cuenta que el vídeo se está adquiriendo.
   4. Haga clic en Modo Cal. A continuación, tome una imagen haciendo clic en Tomar imagen cal. La ruta del directorio de imágenes aparecerá ahora en ".png path" con el nombre de archivo .png con el formato "GridCalibration_YYYYMMDD_img.png".
   5. Mueva el cubo ligeramente y tome otra imagen. Repita de nuevo para un total de 3 imágenes.
   6. Detenga el programa haciendo clic en STOP y luego en el botón de detención. Retire la mano y el cubo que ayudan de la caja.
   7. Tenga cuidado de no golpear nada en la cámara conductual después de que las imágenes de calibración se hayan tomado ese día. Si algo se mueve, es necesario tomar nuevas imágenes de calibración.
3. Ejecute el sistema automatizado.
   NOTA: Determine la configuración de "Umbral de ROI" (que se describe a continuación) para cada espejo antes de ejecutar ratas para la adquisición de datos reales. Una vez que se hayan determinado estos ajustes, preconfigurándolos antes de iniciar el programa y ajuste durante la adquisición si es necesario.
   1. Coloque la rata en la hábil cámara de acceso. Haga clic en la flecha blanca para ejecutar el programa.
   2. Antes de hacer clic en START, establezca la posición del ROI para la detección de la pata ajustando x-Offset (coordenada x de la esquina superior izquierda del rectángulo de ROI), y-Offset (coordenada y de la esquina superior izquierda del ROI), ROI Width y Altura del ROI.
   3. Coloque el ROI en el espejo lateral que muestra el dorso de la pata, directamente delante de la ranura de alcance (Figura2C). Asegúrese de que la barra de entrega de pellets no entre en el ROI y que el ROI no se extienda en la caja para evitar que el pellet o el pelaje de la rata activen un video cuando la rata no está alcanzando.
   4. Haga clic en INICIO para iniciar el programa.
   5. Ajuste el valor "Bajo umbral de ROI" hasta que el "Valor de activación de ROI en vivo" esté oscilando entre "0" y "1" (cuando la rata no está alcanzando). Este valor es el número de píxeles dentro del ROI con valores de intensidad en el intervalo de umbral.
   6. Establezca el Umbral de ROI. Observe el valor del disparador de ROI en vivo cuando la rata mete la nariz en el ROI y cuando la rata alcance el pellet. Establezca el umbral de ROI para que sea significativamente mayor que el "Valor de activación de ROI en vivo" durante los pinchazos de nariz y menor que el "Valor de activación de ROI en vivo" cuando la rata alcance. Ajustar hasta que los vídeos se activen constantemente cuando la rata alcanza, pero no cuando se mete la nariz a través de la ranura
      NOTA: Esto supone que la pata es de color más claro que la nariz; los ajustes se invertirían si la pata es más oscura que la nariz.
   7. Supervise las primeras pruebas para asegurarse de que todo funciona correctamente. Cuando una rata alcanza antes de solicitar un pellet (barra de entrega en la posición "2"), el número de "Llega temprano" aumenta. Cuando una rata llega después de solicitar un pellet (barra de entrega en la posición "3"), el número de "Videos" aumenta y un video se guarda como un archivo .bin con el nombre "RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial".
      NOTA: El valor predeterminado es que los vídeos contengan 300 fotogramas (es decir, 1 s) antes y 1000 fotogramas después del evento de disparo (esto es configurable en el software), que es lo suficientemente largo como para contener todo el movimiento de alcance a agarre, incluida la retracción de la pata.
   8. Una vez alcanzado el tiempo de sesión o el máximo de vídeos, el programa se detiene. Pulse el botón de detención.
   9. Limpie la cámara con etanol y repita con otra rata, o si se hace para el día proceda a convertir videos.
4. Convierta archivos .bin a archivos .avi.
   NOTA: La compresión de vídeos durante la adquisición provoca la pérdida de fotogramas, por lo que los archivos binarios se transmiten al disco durante la adquisición (utilice una unidad de estado sólido debido a las altas tasas de transferencia de datos). Estos archivos binarios deben comprimirse sin conexión o los requisitos de almacenamiento son prohibitivamente grandes.
   1. Abra el programa "bin2avi-color_1473R_noEncode.vi".
   2. En "Control de ruta de archivo" haga clic en el botón de carpeta para seleccionar la sesión (por ejemplo, R0235_20180119a) que desea convertir. Repita el proceso para cada sesión (hasta seis).
   3. Haga clic en la flecha blanca (ejecutar) y luego en "START" para comenzar. Puede supervisar la compresión de vídeo en el "Progreso general (%)" Bar. Deje que el programa se ejecute durante la noche.
   4. Antes de comenzar a entrenar animales al día siguiente, comprueba que los vídeos se han convertido y elimina los archivos .bin para que haya suficiente espacio para adquirir nuevos vídeos.

5. Análisis de vídeos con DeepLabCut

NOTA: Se entrenan diferentes redes para cada preferencia de pata (pata derecha y pata izquierda) y para cada vista (vista directa y vista de espejo izquierdo para ratas con patas derechas, vista directa y vista de espejo derecho para ratas con patas izquierdas). La vista del espejo superior no se utiliza para la reconstrucción 3D, sólo para detectar cuando la nariz entra en la ranura, lo que puede ser útil para desencadenar intervenciones (por ejemplo, optogenética). A continuación, cada red se utiliza para analizar un conjunto de vídeos recortados para la pata y la vista correspondientes.

1. Entrene las redes DeepLabCut (se proporcionan instrucciones detalladas en la documentación de DeepLabCut en https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
   1. Cree y configure un nuevo proyecto en DeepLabCut, un algoritmo de aprendizaje automático para la estimación de poses sin marcadores¹³.
   2. Utilice el programa para extraer fotogramas de los vídeos de alcance cualificado y recortar imágenes a la vista para incluirlos (vista directa o reflejada) en la interfaz del programa. Recorte marcos lo suficientemente grandes para que la rata y ambas patas delanteras sean visibles.
      NOTA: Las redes suelen requerir de 100 a 150 marcos de entrenamiento. Se necesitan más marcos de entrenamiento cuando la pata está dentro en comparación con fuera de la cámara debido a la iluminación. Un recorte más ajustado reduce el tiempo de procesamiento, pero tenga cuidado de que las regiones recortadas sean lo suficientemente grandes como para detectar la trayectoria completa de la pata para cada rata. Debe ser lo suficientemente ancho como para que todo el cuerpo de la rata quepa en el marco (vista directa), y para ver lo más lejos posible en la cámara y delante de la barra de entrega (vista de espejo).
   3. Utilice la GUI del programa para etiquetar las partes del cuerpo. Etiqueta 16 puntos en cada cuadro: 4 articulaciones metacarpofalángicas (MCP), 4 articulaciones interfalángicas proximales (PIP), puntas de 4 dígitos, el dorso de la pata que llega, la nariz, el dorso de la pata no alcanzada y el pellet (Figura 4).
   4. Siga las instrucciones de DeepLabCut (abreviado como DLC a partir de ahora) para crear el conjunto de datos de entrenamiento, entrenar la red y evaluar la red entrenada.
2. Analiza vídeos y refina la red.
   1. Antes de analizar todos los vídeos con una red recién entrenada, analice 10 vídeos para evaluar el rendimiento de la red. Si hay errores consistentes en ciertas posturas, extraiga marcos de entrenamiento adicionales que contengan esas posturas y vuelva a entrenar la red.
   2. Al analizar vídeos, asegúrese de generar archivos .csv, que se introducirán en el código para la reconstrucción de trayectoria 3D.

6. Calibración de la caja

NOTA: Estas instrucciones se utilizan para determinar las matrices de transformación para convertir los puntos identificados en las vistas directas y reflejadas en coordenadas 3D. Para obtener la versión más actualizada y obtener más detalles sobre cómo usar el paquete boxCalibration, consulte Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, que incluye instrucciones paso a paso para su uso.

1. Recopile todas las imágenes de calibración en la misma carpeta.
2. Con ImageJ/Fiji, marque manualmente los puntos del tablero de ajedrez para cada imagen de calibración. Guarde esta imagen como "GridCalibration_YYYYMMDD_.tif" donde 'YYYYMMDD' es la fecha en la que corresponde la imagen de calibración y '' es el número de imagen para esa fecha.
   1. Utilice la función de medición en ImageJ (en la barra de herramientas, seleccione Analizar ? Medir). Esto mostrará una tabla que contiene coordenadas para todos los puntos marcados. Guarde este archivo con el nombre "GridCalibration_YYYYMMDD_.csv", donde la fecha y el número de imagen son los mismos que el archivo .tif correspondiente.
3. En el paquete boxCalibration, abra el archivo 'setParams.m'. Este archivo contiene todas las variables necesarias y su descripción. Edite las variables según sea necesario para ajustarse a las especificaciones del proyecto.
4. Ejecute la función calibrateBoxes. Aparecerán varias solicitudes en la ventana de comandos. El primer mensaje pregunta si se deben analizar todas las imágenes de la carpeta. Al escribir Y finalizará las solicitudes y se analizarán todas las imágenes de todas las fechas. Al escribir N, se pedirá al usuario que introduzca las fechas que desea analizar.
   NOTA: Se crearán dos nuevos directorios en la carpeta de imágenes de calibración: 'markedImages' contiene archivos .png con las marcas de tablero de ajedrez definidas por el usuario en la imagen de calibración. La carpeta 'boxCalibration' contiene archivos .mat con los parámetros de calibración de la caja.
5. Ejecute la función checkBoxCalibration. Esto creará una nueva carpeta, 'checkCalibration' en la carpeta 'boxCalibration'. Cada fecha tendrá una subcarpeta que contiene las imágenes y varios archivos .fig, que se utilizan para verificar que la calibración de la caja se completó con precisión.

7. Reconstrucción de trayectorias 3D

1. Ensamble los archivos .csv que contienen la salida del programa de aprendizaje en la estructura de directorios descrita en el script reconstruct3Dtrajectories.
2. Ejecute reconstruct3Dtrajectories. Este script buscará la estructura de directorios y coincidirá con los puntos directos/espejo en función de sus nombres en el programa de inclinación (es importante utilizar los mismos nombres de partes de cuerpo en ambas vistas).
3. Ejecute calculateKinematics. Este script extrae características cinemáticas simples de las reconstrucciones de trayectoria 3D, que se pueden adaptar a las necesidades específicas.
   NOTA: El software calcula la posición de las partes del cuerpo ocluidas en función de sus vecinos y su ubicación en la vista complementaria (por ejemplo, la ubicación de una parte del cuerpo en la vista de cámara directa restringe sus posibles ubicaciones en la vista reflejada). Para las ocasiones en las que la pata se ocluye en la vista de espejo a medida que pasa a través de la ranura, las coordenadas de la pata se interpolan en función de los fotogramas vecinos.

Resultados

Las ratas adquieren la tarea de alcance experto rápidamente una vez aclimatedcado al aparato, con el rendimiento estancado en términos de número de alcances y precisión durante 1-2 semanas (Figura5). La Figura 6 muestra fotogramas de vídeo de ejemplo que indican estructuras identificadas por DeepLabCut, y la Figura 7 muestra trayectorias de alcance individuales superpuestas desde una sola sesión. Finalmente, en ...

Discusión

El alcance especializado en roedores se ha convertido en una herramienta estándar para estudiar la fisiología del sistema motor y la fisiopatología. Hemos descrito cómo implementar una tarea automatizada de alcance experto en ratas que permite: entrenamiento y pruebas con supervisión mínima, reconstrucción de trayectoria de patas y dígitos 3D (durante el alcance, agarre y retracción de la pata), identificación en tiempo real de la pata durante el alcance, y la sincronización con la electrónica externa. Es adecuado para c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
paneles de policarbonato transparente	TAP Plásticos cortados		a pedido (ver diseño de la caja)
fuente/detector de infrarrojos	ENV-253SD	de 30"	Med Associates
	Basler	acA2000-340kc	2046 x 1086 CMV2000 340 fps Lente de cámara Color Camera Link
	Megapixel (computar)	M0814-MP2	2/3" 8mm f1.4 con bloqueo Iris & Cables
cámara	de enfoque Basler	#2000031083	Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Cables de datos
Espejos Actuador	Amazon
	Concéntrico	LACT6P	Carrera de 6" (nominal), 110 lb de fuerza, 12 VDC, con potenciómetro
depósito/embudo de pellets	Amico (Amazon)	a12073000ux0890	Embudo
tubo guía	ePlastics	ACREXT.500X.250	1/2" OD x 1/4" ID Transparente. Tubo acrílico de plexiglás extruido x
varilla de entrega de pellets	ePlastics	ACRCAR.250	0.250 "DIA. Varilla acrílica fundida (2' longitud)
conector T de plástico	United States Plastic Corp	#62065	3/8" x 3/8" x 3/8" ID de manguera Camiseta de HDPE negro
Luces LED	Iluminación EVER	4100066-DW-F	Tira de luz LED impermeable flexible de 12 V, cinta LED, luz diurna blanca, súper brillante 300 unidades 5050 LEDS, carrete de 16.4 pies y 5 m
respaldo	de luz ePlastics	ACTLNAT0.125X12X36 0.125	"x 12" x 36" Lámina de acetal natural
Películas difusoras de luz	inventables	23114-01.007x8.5x11	", gabinete mate de dos lados
y materiales de marco personalizados	varios (Home Depot, etc.)		Tablero de fibra de 3/4" (consulte el protocolo para conocer las dimensiones de cada estructura)
Espuma acústica	Acoustic First		FireFlex Wedge Espuma acústica (2" de espesor)
ventiladores	Cooler Master (Amazon)	B002R9RBO0	Rifle Bearing 80mm Ventilador de enfriamiento silencioso para cajas de computadora y CPU
Bisagras de la puerta del gabinete	Everbilt (Home Depot	#14609	bisagra de acero continua (1.4" x 48")
ruedas de gabinete	Everbilt (Home Depot	#49509	Rueda de placa giratoria de goma blanda con capacidad de carga de 90 lb y freno lateral
manija de la puerta del gabinete	Everbilt (Home Depot	#15094	Tirador de puerta de servicio ligero blanco (4.5")
computadora	Hewlett Packard	Z620	HP Z620 Estación de trabajo de escritorio
Camera Link Frame Grabber	National Instruments	#781585-01	PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Enlace de cámara - Tablero
RIO multifunción	National Instruments	#781100-01	PCIe-17841R
Cable de placa RIO analógico	National Instruments	SCH68M-68F-RMIO	Cable digital
placa RIO	Instruments nacionales	#191667-01	SHC68-68-RDIO Cable digital para
bloque de terminales analógico	National Instruments	#782536-01	SCB-68A Rechazo de ruido, bloque de conector de E/S blindado
Bloque de terminales digitales	National Instruments	#782536-01	SCB-68A rechazo de ruido, bloque de conector de E/S blindado bastidor
relé de 24 posiciones	Measurement Computing Corp.	SSR-RACK24	Placa posterior de relé de estado sólido (relés tipo Gordos/OPTO-22), conmutador de CC de 24 canales
	Measurement Computing Corp.	SSR-ODC-05 Módulo de	relé de estado sólido, único, interruptor de CC, 3 a 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense	Measurement Computing Corp.	SSR-IDC-05 módulo de	relé de estado sólido, simple, detección de CC, 3 a 32 V CC
Fuente de alimentación de CC	BK Precision	1671A	Triple salida 30 V, 5 A Fuente de alimentación de CC Fuente de alimentación de CC Pellets de
azúcar	Bio Serv	F0023	Pellets de precisión sin polvo, 45 mg, sacarosa (sin sabor)
LabVIEW	National Instruments	LabVIEW 2014 SP1, versiones de 64 y 32 bits	Se requiere LabVIEW de 64 bits para acceder a suficiente memoria para transmitir videos, pero la codificación FPGA debe realizarse en LabVIEW
MATLAB	de	Matlab R2019a	está escrito en Matlab y requiere la caja de herramientas Computer Vision