Aquí se describe un procedimiento operativo estándar simplificado para la elaboración de perfiles de microbiomas mediante la secuenciación y el análisis metagenómicos de 16S rRNA utilizando herramientas disponibles gratuitamente. Este protocolo ayudará a los investigadores que son nuevos en el campo del microbioma, así como aquellos que requieren actualizaciones sobre los métodos para lograr el perfilado bacteriano a una resolución más alta.
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Artículo de método
Análisis de microbiota utilizando PCR de dos pasos y secuenciación genética de rRNA 16S de próxima generación
En este artículo
Resumen
Resumen
El intestino humano es colonizado por billones de bacterias que apoyan funciones fisiológicas como el metabolismo de los alimentos, la recolección de energía, y la regulación del sistema inmunológico. Se ha sugerido que la perturbación del microbioma intestinal sano desempeña un papel en el desarrollo de enfermedades inflamatorias, incluida la esclerosis múltiple (EP). Los factores ambientales y genéticos pueden influir en la composición del microbioma; por lo tanto, la identificación de comunidades microbianas vinculadas con un fenotipo de la enfermedad se ha convertido en el primer paso hacia la definición del papel del microbioma en la salud y la enfermedad. El uso de la secuenciación metagenómica de 16S rRNA para la generación de perfiles de la comunidad bacteriana ha ayudado a avanzar en la investigación del microbioma. A pesar de su amplio uso, no existe un protocolo uniforme para el análisis de perfiles taxonómicos basado según rRNA 16S. Otra limitación es la baja resolución de la asignación taxonómica debido a dificultades técnicas tales como lecturas de secuenciación más pequeñas, así como el uso de sólo lecturas hacia adelante (R1) en el análisis final debido a la baja calidad de lecturas inversas (R2). Es necesario un método simplificado con alta resolución para caracterizar la diversidad bacteriana en un bioespécme dado. Los avances en la tecnología de secuenciación con la capacidad de secuenciar lecturas más largas a alta resolución han ayudado a superar algunos de estos desafíos. La tecnología de secuenciación actual combinada con una canalización de análisis metagenómico disponible al público, como Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basado en R, ha ayudado a avanzar en el perfilmicrobiano a alta resolución, ya que DADA2 puede asignar secuencia en el género y los niveles de especies. Aquí se describe una guía para realizar perfiles bacterianos utilizando amplificación en dos pasos de la región V3-V4 del gen rRNA 16S, seguido de un análisis utilizando herramientas de análisis disponibles libremente (es decir, DADA2, Phyloseq y METAGENassist). Se cree que este flujo de trabajo simple y completo servirá como una excelente herramienta para los investigadores interesados en realizar estudios de perfildeo de microbioma.
Introducción
Microbiota se refiere a una colección de microorganismos (bacterias, virus, arqueas, bacteriófagos y hongos) que viven en un entorno particular, y el microbioma se refiere al genoma colectivo de los microorganismos residentes. Como las bacterias son uno de los microbios más abundantes en humanos y ratones, este estudio se centra sólo en el perfil aseguir bacterias. El intestino humano es colonizado por billones de bacterias y cientos de cepas bacterianas1. La microbiota intestinal normal desempeña un papel vital en el mantenimiento de un estado saludable en el huésped mediante la regulación de las funciones (es decir, el mantenimiento de una ba....
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Protocolo
El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Iowa.
1. Recolección y Manipulación de Muestras Fecales
- Esterilice las cajas divisoras (ver Tabla de Materiales, Figura Suplementaria 1)con 70% de etanol.
- Pre-etiquetar tubos de microcentrífuga (uno por ratón) con el ID de muestra y el grupo de tratamiento (si corresponde).
- Coloque los ratones en cajas divisoras esterilizadas y permítales defecar normalmente hasta 1 h.
- Recoja los gránulos fecales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preetiquetado y preetiquetado ....
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Resultados
Como las moléculas MHC clase II (HLA en humanos) son actores centrales en la respuesta inmune adaptativa y muestran fuertes asociaciones con una predisposición a MS24,25,26, se hipotetizó que la molécula HLA clase II influiría en la composición microbiana intestinal. Por lo tanto, los ratones que carecían del gen MHC clase II (AE.KO) o expresaban el gen HLA-DQ8 humano (HLA-DQ8) se utilizaron para comprender la importancia de las.......
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Discusión
El protocolo descrito es simple, con pasos fáciles de seguir para realizar perfiles de microbioma utilizando la secuenciación metagenómica de rRNA 16S de un gran número de biorespecímenes de interés. La secuenciación de próxima generación ha transformado los estudios de ecología microbiana, especialmente en los modelos de enfermedades humanas y preclínicas31,32. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para analizar con éxito composiciones microbianas.......
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Divulgaciones
A. M. recibió regalías de Mayo Clinic (pagada por Evelo Biosciences) como uno de los inventores de una tecnología que reclama el uso de Prevotella histicola para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.
Agradecimientos
Los autores reconocen la financiación del NIAID/NIH (1R01AI137075-01), la Beca Carver Trust Medical Research Initiative y el Centro de Investigación en Ciencias de la Salud Ambiental de la Universidad de Iowa, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrígugo natural de 1,5 mL | EE. UU., Scientific | 1615-5500 | Recolección fecal |
| Aplicador manual 3M Escobilla de goma PA1-G | 3M, MN, US | Squeger para el correcto sellado de la placa de PCR | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, EE. UU | A63880 | Purificación de PCR, limpieza de NGS, limpieza de PCR |
| Reactivo Agilent DNA 1000 Agilent | Technologies, CA, EE. UU. | 5067-1504 | Cuantificación de ADN y control de calidad |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, EE. UU. | 5067-1504 | Cuantificación de ADN y control de calidad |
| Tapas de repuesto del adoptante del índice | Illumina, Inc., CA, EE. UU. | 15026762 | Nueva tapa para el cebador adoptante de índice 1 y 2 |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio ahora parte de QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA aislamiento |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, EE. UU | KK2602 | Mezcla preparada para PCR Amplicon PCR1 y PCR2 indexado |
| Cajas divisorias Lewis | Bins, WI, EE. UU | . ND03080 | Recogida de heces |
| Soporte magnético | Nueva Inglaterra BioLabs, MA, EE. UU | S1509S | para limpieza de PCR |
| MicroAmp Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos MicroAmp | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, EE. UU | . 4346906 | Placa de PCR |
| MicroAmp Película adhesiva óptica | Biosystems aplicada, Thermo Fisher Scientific, CA, EE. UU | . 4311971 | Sellador de placas de PCR |
| Centrífuga Microfuge 20 | Beckman Coulter, IN, EE. UU | B30154 | Centrífuga utilizada para el aislamiento de ADN |
| Kit de reactivos MiSeq (600 ciclos)v.3 | Illumina, Inc., CA, EE. UU | MS-102-3003 | Para la secuenciación de MiSeq |
| Kit de preparación de la biblioteca de ADN Nextera XT | Illumina, Inc., CA, EE. UU | FC-131-1001 | 16S rRNA Preparación de la biblioteca de ADN |
| Depósitos de reactivos Bandejas multicanal | ASI, FL, EE. UU | RS71-1 | para la agrupación de cetrifugo de placa de producto PCR2 |
| Thermo Fisher Scientific, CA, EE. UU | 75004393 | Para la mezcla de reactivos de PCR y la eliminación de burbujas de aire de la placa | |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, EE. UU | FC-110-3001 | para el control de secuenciación MiSeq Kit |
| purificación de ADN del microbioma | Thermo Fisher Scientific, CA, EE. UU | A29789 | Para la purificación del producto PCR1 |
| Homogeneizador PowerLyzer 24 | Omni International, GA, EE. UU. | 19-001 | Batidor de cuentas para el kit |
| ensayo Qubit dsDNA HS (alta sensibilidad) | Thermo Fisher Scientific, CA, EE. UU | Q32854 | Cuantificación de ADN |
| Accesorio de placa de índice TruSeq | Illumina, Inc., CA, EE. UU | FC-130-1005 | Para la disposición de los cebadores de índice |
| Divisores verticales (grandes) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Colección fecal |
| Divisores verticales (pequeños) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Colección fecal |
Referencias
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. J....
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Reimpresiones y permisos
