Artículo de método

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

DOI:

10.3791/59981

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14 de noviembre de 2019

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1Translational Genomic Research Institute, 2Arizona Alzheimer's Consortium, 3Banner Sun Health Research Institute

En este artículo

Resumen

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Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los ARN circulares (circARN) son una clase de ARN no codificantes que participan en funciones que incluyen la regulación del microARN (miRNA), la mediación de interacciones proteínas y proteínas y la regulación de la transcripción genética parental. En la secuenciación clásica de ARN de próxima generación (RNA-seq), los círculos se pasan por alto típicamente como resultado de la selección de poli-A durante la construcción de bibliotecas de ARNm, o se encuentran en muy baja abundancia, y por lo tanto son difíciles de aislar y detectar. Aquí, se optimizó un protocolo de construcción de la biblioteca de circRNA comparando kits de preparación de bibliotecas, opciones de pretratamiento y varias cantidades totales de entrada de ARN. Se probaron dos kits de preparación de bibliotecas de transcriptomes completos disponibles en el uso comercial, con y sin pretratamiento de RNase R, y utilizando cantidades variables de entrada total de ARN (1 a 4 g). Por último, múltiples tipos de tejido; incluyendo hígado, pulmón, ganglio linfático y páncreas; así como múltiples regiones cerebrales; incluyendo el cerebelo, el lóbulo parietal inferior, el giso temporal medio, la corteza occipital y el giso frontal superior; se compararon para evaluar la abundancia de circARN a través de tipos de tejidos. El análisis de los datos de ARN-seq generados utilizando seis herramientas diferentes de detección de ARN (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC y CIRCexplorer) reveló que un kit de preparación de la biblioteca de ARN total varado con pretratamiento RNase R y entrada de ARN de 4 g es el óptimo método para identificar el mayor número relativo de circRNAs. De acuerdo con los hallazgos anteriores, se observó el mayor enriquecimiento de los circRNAs en los tejidos cerebrales en comparación con otros tipos de tejidos.

Introducción

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Los ARN circulares (ArnNA) son ARN endógenos y no codificantes que han ganado atención dada su expresión generalizada en el transcriptoma eucariota1,2,3. Se forman cuando los exons se empalman entre sí y por lo tanto se consideraron inicialmente como artefactos de empalme4,5. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los circRNAs exhiben tipo de célula, tejido y etapa específica del desarrollo expresión específica3,6 y se conservan evolutivamente2,3. Además, participan en la mediación de interacciones proteína-proteína7,la unión de microARN (miRNA)3,8,9,10, y la regulación de la transcripción genética parental11.

En la secuenciación clásica de ARN (RNA-seq), los círculos pueden perderse por completo durante la construcción de la biblioteca como resultado de la selección de poli-A para ARNm o pueden ser difíciles de aislar dada su baja abundancia. Sin embargo, estudios recientes de caracterización de circRNA han incorporado un paso de pretratamiento utilizando RNase R con el fin de enriquecer para circRNAs2,12,13. RNase R es una exoribonucleasa que digiere los ARN lineales, dejando atrás estructuras circulares de ARN. Los protocolos de enriquecimiento de CircRNA se optimizaron generando y comparando datos de dos kits de construcción de bibliotecas de transcriptomes completos disponibles comercialmente, con y sin un paso de pretratamiento RNase R, y utilizando cantidades variables de entrada total de ARN (1 a 4 g). El protocolo optimizado se utilizó a continuación para evaluar la abundancia de circRNAs en cinco regiones cerebrales diferentes (cerebelo [BC], lóbulo parietal inferior [IP], giso temporal medio [MG], corteza occipital [OC] y gros frontal superior [SF]) y otros cuatro tipos de tejido (hígado [LV], pulmón [LU], ganglio linfático [LN] y páncreas [PA]). Las bibliotecas RNA-seq se emparejaron secuenciadas finales y los datos se analizaron utilizando seis algoritmos de predicción de circRNA diferentes: find_circ3, CIRI14,Mapsplice15,KNIFE16, DCC17y CIRCexplorer18. Según nuestro análisis, se detectó el mayor número de circRNAs únicos cuando se utilizó un kit de preparación de la biblioteca de ARN total varado con pretratamiento RNase R y ARN de entrada total de 4 g. El protocolo optimizado se describe aquí. Como se informó anteriormente19,20, el mayor enriquecimiento de los círculos en el cerebro en comparación con otros tipos de tejido.

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Protocolo

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Esta investigación se ha llevado a cabo de acuerdo con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Los tejidos cerebrales se obtuvieron del Programa de Donación cerebral y corporal del Instituto de Investigación de la Salud del Sol Banner en Sun City, AZ. Las operaciones del Programa de Donación cerebral y corporal son aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de Occidente (protocolo #20120821). Todos los sujetos o sus representantes legales firmaron el consentimiento informado. Los bioespecímenes comerciales (no cerebrales) fueron comprados a Proteogenex.

1. Tratamiento RNase R

NOTA: En los pasos siguientes, el volumen de reacción se ajusta a un volumen total de 50 sL. Este es el volumen de muestra mínimo que se utilizará en el kit de limpieza y concentrador de ARN (ver Tabla de Materiales). Además, el protocolo optimizado descrito aquí es para una cantidad de entrada de 4 g de ARN total. Se recomienda un tiempo de incubación más largo para el tratamiento con RNase R para una cantidad de entrada >4 g.

  1. Diluir el ARN total a 4 g en agua libre de RNase de 39 ml en un tubo de microcentrífuga y mezclar bien mediante pipeteo.
  2. En un tubo separado, diluir la RNase R a una concentración de trabajo de 2 U/L con 1 búfer de reacción RNase R. Haga sólo lo suficiente para su uso inmediato.
  3. Pipetear 39 l de ARN total y 5 l de búfer de reacción RNase 10x renase en un tubo de reacción de 1,5 ml y mezclar bien mediante pipeteo (50 l será el volumen de reacción total). A continuación, añadir 6 l de RNase R (2 U / L).
  4. Ajuste la pipeta al volumen de reacción completo (50 l) y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces.
  5. Colocar el tubo en un baño de agua de 37 oC durante 10 minutos. Asegúrese de que el volumen de reacción completo esté sumergido en el baño de agua.
  6. Coloque el tubo sobre hielo y proceda inmediatamente con la limpieza y concentración del ARN (sección 2).

2. Purificación de ARN utilizando un kit de limpieza y concentrador de ARN

NOTA: Cuando se utiliza ARN de alta calidad (RIN>8, DV200>80%), el tratamiento con RNase R puede resultar en una pérdida de aproximadamente el 60% de ARN. Usando una entrada de 4 g, se estima que 2–2,5 g de ARN tratado se deja después de la sección 1.

  1. Antes de empezar, prepare el búfer de lavado de ARN añadiendo 48 ml de etanol al 100% al concentrado tampón y mezcle bien pipeteando. Coloque las columnas de purificación en los tubos de recogida (ver Tabla de materiales)y colóquelas en un estante de tubo.
    NOTA: Utilice los siguientes ajustes de centrifugación para todos los pasos siguientes: 10.000–16.000 x g. Si ya se ha realizado el tratamiento con DNase I, omita el tratamiento con DNase I en esta etapa.
  2. Añadir 2 volúmenes de búfer de enlace de ARN a la muestra tratada RNase R, y mezclar bien mediante pipeteo (volumen total: 150 l).
  3. Añadir 1 volumen de 100% de etanol a la mezcla de muestras tratadas con ARN Binding Buffer y RNase R, y mezclar bien pipeteando (volumen total: 300 l).
  4. Transfiera todo el volumen a la columna y centrifugar la columna durante 30 s. Deseche el flujo a través.
  5. Agregue 400 l de búfer de preparación de ARN directamente a la columna, centrifugar la columna durante 30 s y deseche el flujo a través.
  6. Agregue 700 s de ARN Wash Buffer directamente a la columna, centrifugar la columna durante 30 s y deseche el flujo.
  7. Añadir 400 l de búfer de lavado de ARN directamente a la columna, centrifugar la columna durante 2 minutos y transferir la columna a un tubo fresco sin RNase de 1,5 ml.
  8. Agregue 11 l de agua libre de RNase directamente a la columna sosteniendo la punta de la pipeta justo encima del filtro de columna y asegurándose de que el agua aterrice solo en el filtro de columna.
  9. Incubar la columna durante 1 min a temperatura ambiente y centrifugar durante 1 min.
  10. Antes de desechar la columna, compruebe si hay flujo en el tubo libre de RNase. Si la elución se realizó correctamente, almacene la muestra a -80 oC o proceda inmediatamente con la preparación de la biblioteca. El volumen de elución total final de aproximadamente 10 l se utiliza para la construcción de la biblioteca.
    NOTA: Punto de parada: Deje el ARN a -80 oC durante un máximo de 7 días antes de continuar con la preparación de la biblioteca.

3. Preparación de la biblioteca de circRNA

NOTA: Consulte Tabla de materiales para el kit, que contiene la mayoría de los reactivos utilizados en esta sección.

  1. rRNA agotamiento y fragmentación
    1. Transfiera 10 ml de ARN purificado del paso 2.10 a un pozo limpio en una nueva placa PCR de 96 pocillos de 0,3 ml. Para el pozo, agregue 5 l de tampón de enlace de arnm seguido de una mezcla de eliminación de arRNA de 5 l. Pipetear suavemente 10 veces para mezclar.
    2. Sellar la placa e incubar durante 5 min a 68oC sobre un bloque termociclador preprogramado y precalentado. Después de la finalización de la incubación de 5 minutos, coloque la placa en el banco e incubar a temperatura ambiente durante 1 min.
    3. Retire el sello de la placa. Añadir 35 l de perlas de eliminación de ARN raxaaa a temperatura ambiente vórtice a la muestra. Ajuste la pipeta a 45 s y la pipeta hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces para mezclar bien. Placa de incubación durante 1 min a temperatura ambiente.
    4. Transfiera la placa a un soporte magnético e incubar en el soporte durante 1 min o hasta que la solución se despeje. Transfiera todo el sobrenadante (45 l) a un pozo nuevo en la misma placa, o placa nueva (dependiendo de cuántas muestras esté trabajando).
    5. Vortex las perlas de limpieza de ARN (ver Tabla de Materiales) hasta que estén bien dispersas, y añadir 99 l de perlas a cada muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10x para mezclar. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 min.
    6. Transfiera la placa al soporte magnético e incubar 5 minutos adicionales o hasta que la solución se despeje. Retire y deseche todo el sobrenadante del pozo.
    7. Con la placa todavía en el soporte magnético, añadir 200 s de EtOH recién preparado 80% al pozo sin interrumpir las cuentas. Incubar durante 30 s, luego retirar y desechar el etanol. Repita el proceso para un total de 2 lavados.
    8. Agregue 11 ml de búfer de elución a cada pocto y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min, y luego transferir al soporte magnético hasta que la solución se despeje (1-5 min).
    9. Transfiera 8,5 l del sobrenadante del pozo a un pozo nuevo en la misma placa o a una placa nueva. Añadir 8,5 l de la mezcla Elute, Primer, Fragmento alto a cada pozo que contenga la muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo.
    10. Sellar la placa e incubar durante 8 min a 94oC sobre un bloque termociclador preprogramado y precalentado. Retirar del termociclador cuando alcance los 4oC y centrifugar brevemente.
      NOTA: Proceda inmediatamente al protocolo CDNA Synthesize First Strand.
  2. Sintetizar cDNA
    1. Para cada muestra que se esté preparando, mezcle la mezcla de síntesis de primera hebra de 9 l con 1 l de transcriptasa inversa (ver Tabla de materiales). Añadir 8 l de la mezcla a la muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 6 veces para mezclar.
      1. Sellar la placa e incubar en un bloque termociclador preprogramado y precalentado utilizando los siguientes parámetros: 25oC durante 10 min, 42oC durante 15 min, 70oC para 15 min, 4oC de retención. Proceda inmediatamente a la síntesis de la segunda hebra.
    2. Añadir 5 l de tampón de resuspensión a cada muestra seguido de 20 l de mezcla maestra de marcado de segunda hebra. Pipetear todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 6 veces.
    3. Sellar la placa e incubar en un bloque termociclador preprogramado y precalentado ajustado a 16oC durante 1 h. Después de la incubación, retire la placa del termociclador y déjela a la temperatura ambiente.
    4. Cuentas de purificación de PCR vórtes (ver Tabla de Materiales)y añadir perlas de 90 l a cada pozo de muestra. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Transfiera la mezcla de perlas/muestras al soporte magnético e incubar durante 5 min o hasta que el líquido se despeje. Retire y deseche el sobrenadante.
    6. Añadir 200 l de 80% EtOH a cada muestra. Incubar muestras en el soporte magnético a temperatura ambiente durante 30 s. Deseche el sobrenadante. Repita 1x.
    7. Deje que las perlas se sequen a temperatura ambiente durante 6 minutos y, a continuación, retírelas del soporte magnético.
    8. Resuspenda las perlas en 19,5 ml del tampón de resuspensión. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar a fondo. Incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos, luego transferir al soporte magnético e incubar durante 1 min adicional o hasta que el líquido se despeje.
    9. Transfiera 17,5 l de sobrenadante a un pozo nuevo/placa nueva.
      NOTA: Si no procede inmediatamente, las muestras pueden almacenarse a -20 oC durante un máximo de 7 días.
  3. Preparación de la biblioteca
    1. Añadir 12,5 l de mezcla A-Tailing a cada pocal que contenga sobrenadante. Pipetear todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar.
    2. Incubar la reacción en un bloque termociclador preprogramado y precalentado ajustado a 37 oC utilizando los siguientes parámetros: 37 oC durante 30 min, 70 oC para 5 min, 4 oC de retención. Cuando las muestras alcancen los 4 oC, proceda inmediatamente a la ligadura del adaptador.
    3. A cada muestra añadir 2,5 ml de tampón de resuspensión, 2,5 ml de un adaptador de ARN único y 2,5 ml de mezcla de ligaduración. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10x para mezclar.
    4. Incubar muestras en un bloque termociclador preprogramado y precalentado a 30 oC durante 10 min.
    5. Agregue 5 ml de búfer Stop Ligation a cada muestra y pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    6. Añadir 42 s l de perlas de purificación de PCR mixtas a cada muestra y mezclar bien. Siga los pasos 3.2.6 a 3.2.10, pero cambie el volumen de resuspensión a 52 s y el volumen de elución final a 50 s.
    7. Repita el protocolo de perlas de purificación de PCR de nuevo con la elución de 50 l de la etapa 3.3.6, pero cambie el volumen de resuspensión a 22 l y el volumen de elución final a 20 l.
      NOTA: Si no procede inmediatamente, las muestras pueden almacenarse a -20 oC durante un máximo de 7 días.
    8. Añadir 5 s de PCR Primer Cocktail y 25 l de PCR Master Mix a cada muestra. Mezclar pipeteando 10 veces. Incubar la reacción en un bloque termociclador preprogramado y precalentado utilizando los siguientes parámetros: 98 oC durante 30 s; a continuación, 8 ciclos de 98 oC para 10 s, 60 oC para 30 s y 72 oC para 30 s; luego 72 oC durante 5 min, luego 4 oC de retención.
      NOTA: La optimización del número total de ciclos de PCR puede ser necesaria para generar cantidades suficientes de biblioteca para la secuenciación.
    9. Siga el protocolo para la purificación de perlas de PCR (pasos 3.2.4 a 3.2.9), excepto añadir 50 l de perlas de purificación de PCR bien mezcladas y cambiar el volumen de resuspensión a 32,5 l con un volumen de elución final de 30 l.
      NOTA: Las muestras deben almacenarse a -20 oC.
  4. Cuantificación y Control de Calidad utilizando un analizador de ácido nucleico
    1. Permita que las cintas y los reactivos se equilibren a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Mezclar 2 l de biblioteca con 2 l de tampón HS D1000 y añadir a una placa de pozo compatible.
    3. Selle firmemente con sello de lámina compatible y vórtice durante 1 min a 2.000 rpm.
    4. Gire hacia abajo y cargue la placa en el analizador siguiendo las indicaciones de software.
      NOTA: Las bibliotecas deben tener aproximadamente 260 bp de tamaño.

4. Flujo de trabajo de análisis de datos

  1. Secuenciar bibliotecas de ARN-seq (consulte Tabla de materiales) para generar lecturas de extremo emparejado de 82 bp. Convierta los datos de secuenciación sin procesar en forma de archivos basecall (.bcl) en FASTQ utilizando la herramienta bcl2fastq (v0.2.19).
  2. Detectar circARN.
    NOTA: Basándonos en la evidencia previamente reportada de que un enfoque de detección de círculos de conjunto funciona mejor en comparación con el uso de una sola herramienta de detección21,22, sugerimos el uso de múltiples herramientas para la detección de circRNA. Aquí, los circRNA se identificaron utilizando seis algoritmos de predicción de circRNA existentes: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE y DCC, aplicando la configuración de parámetros recomendada para cada algoritmo.
    1. Descargue e instale cada algoritmo de detección de círculos en un clúster informático de alto rendimiento de Linux utilizando las instrucciones proporcionadas por los desarrolladores.
    2. Alinee los TAq DE ARN-seq con el genoma de referencia (GRCh37), utilizando el alineador recomendado para cada herramienta.
    3. Después de la alineación, ejecute algoritmos de detección de círculos aplicando sus respectivos parámetros recomendados.
    4. Cada herramienta generará un archivo de resultados de varias columnas con la lista de círculos detectados, extraerá las coordenadas de circRNA y el número de lecturas de apoyo de esto con el fin de cuantificar el número de candidatos detectados en cada condición de muestra/prueba.
  3. Convierta la salida de coordenadas de circRNA por CIRI, Mapsplice y DCC en coordenadas basadas en 0 para que sean coherentes con los otros tres algoritmos.
  4. Seleccione los círculos circulares con dos o más lecturas de soporte o análisis y comparaciones posteriores. La Tabla 1 resume todos los parámetros evaluados en nuestro estudio junto con el número total de lecturas de secuenciación generadas para cada muestra.
  5. Para cada condición de muestra/prueba, cuente el número de circRNAs detectados normalizados en el número de lecturas asignadas generadas para esa biblioteca, por millón. Resuma los resultados en las distintas herramientas/muestras en las gráficas de cuadro, como se detalla en los Resultados representativos.

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Resultados

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Los datos generados utilizando un ARN de control universal (UC) disponible comercialmente y utilizando dos kits de preparación de bibliotecas, que incluyen un paso de agotamiento de riboentos en sus protocolos, se evaluaron por primera vez. Utilizando un flujo de trabajo analítico (flujo de trabajo de análisis de datos, sección 4), en general, se detectó un mayor número de círculos en los conjuntos de datos TruSeq en comparación con los de Kapa (Figura 1). Aunque los porcentajes de ARN ribos...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, se probaron dos kits de preparación de bibliotecas disponibles comercialmente, opciones de pretratamiento y cantidades de ARN de entrada con el fin de optimizar un protocolo de enriquecimiento de circRNA para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA. Sobre la base de las evaluaciones de este estudio, una serie de aspectos clave y pasos críticos en la creación de bibliotecas de secuenciación de circRNA son evidentes. Nuestra evaluación confirma la utilidad del pretratamiento RNase R, com...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Estamos agradecidos al Programa de Donación de Cerebros y Cuerpos del Instituto de Investigación de la Salud del Sol Banner (BBDP, por sus siglas en la) cuenta con el suministro de tejidos cerebrales humanos. El BBDP ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), el National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), el Departamento de Servicios de Salud de Arizona (contrato 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), la Comisión de Investigación Biomédica de Arizona (contratos 4001, 0011, 05-901 y 1001 al Consorcio de Enfermedad de Parkinson de Arizona) y el Consorcio de Enfermedadde Parkinson de Arizona) y el Consorcio Michael J. Fundación Fox para la Investigación de Parkinson27. Este estudio también fue apoyado por el DHS y el Estado de Arizona (aun vez ala DeDHS 14-052688). También agradecemos a Andrea Schmitt (Banner Research) y Cynthia Lechuga (TGen) por su apoyo administrativo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1.000 y micro; L puntas de pipetaRaininGP-L1000F
20 µ L puntas de pipetaRaininSR L 10F
200 µ Puntas de pipetaL RaininSR L 200F
2200 TapeStation Accesorios (cubiertas de lámina)Agilent Technologies5067-5154
2200 TapeStation Accesorios (puntas)Agilent Technologies5067-5153
Película adhesiva para microplacasVWR60941-064
AMPure XP Beads 450 mLBeckman CoulterA63882Purificación por PCR
Placas de PCR Eppendorf twin.tec de 96 pocillosReactivos
Agilent Technologies5067-5585
Cinta de pantalla D1000 de alta sensibilidadAgilent Technologies5067-5584
HiSeq 2500 Sistema de secuenciaciónIlluminaSY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster KitIlluminaPE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 ciclos)IlluminaFC-410-1002
HiSeq 4000 Sistema de secuenciaciónIlluminaSY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2IlluminaPE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 ciclos)IlluminaFC-402-4022
Kapa Total RNA KitRocheKK8400
Etanol de grado de biología molecularCentro
qubitsThermo FischerQ32856
kit de ensayo de alto sentido qubit dsDNAde Thermo FischerQ32854
Limpieza y concentrador de ARN - 5ZymoRCC-100Contiene columnas de purificación, tubos de recolección
Perlas RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsARN
Rnase RLucigenRNR07250
SuperScript II transcriptasa inversa 10.000 unidadesThermoFisher (LifeTech)18064014
TapeStation 2200 Analizadorácidos nucleicosAgilent Technologies
TElowEVWR10128-588
Kit de preparación de bibliotecas de ARN total trenzado TruSeqIllumina20020596 Kit utilizado en la sección 3
Bandeja dividida de dos compartimentosVWR3054-1004
agua ultrapuraThermo Fischer10977-015
ARN de control universalAgilent740000
D1000 de alta sensibilidad 951020401 de suministro de tubos de ensayo de BP28184 de Fisher Scientific de Centro de suministro de Perlas de limpieza de de de Centro de suministro de de

Referencias

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