Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Shobana Sekar; Philipp Geiger; Lori Cuyugan; Annalee Boyle; Geidy Serrano; Thomas G. Beach; Winnie S. Liang

doi:10.3791/59981

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Artículo de método

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

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DOI:

10.3791/59981

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14 de noviembre de 2019

Shobana Sekar¹^,² , Philipp Geiger¹^,² , Lori Cuyugan¹^,² , Annalee Boyle¹^,² , Geidy Serrano²^,³ , Thomas G. Beach²^,³ , Winnie S. Liang¹^,²

¹Translational Genomic Research Institute, ²Arizona Alzheimer's Consortium, ³Banner Sun Health Research Institute

En este artículo

Resumen

Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.

Resumen

Los ARN circulares (circARN) son una clase de ARN no codificantes que participan en funciones que incluyen la regulación del microARN (miRNA), la mediación de interacciones proteínas y proteínas y la regulación de la transcripción genética parental. En la secuenciación clásica de ARN de próxima generación (RNA-seq), los círculos se pasan por alto típicamente como resultado de la selección de poli-A durante la construcción de bibliotecas de ARNm, o se encuentran en muy baja abundancia, y por lo tanto son difíciles de aislar y detectar. Aquí, se optimizó un protocolo de construcción de la biblioteca de circRNA comparando kits de preparación de bibliotecas, opciones de pretratamiento y varias cantidades totales de entrada de ARN. Se probaron dos kits de preparación de bibliotecas de transcriptomes completos disponibles en el uso comercial, con y sin pretratamiento de RNase R, y utilizando cantidades variables de entrada total de ARN (1 a 4 g). Por último, múltiples tipos de tejido; incluyendo hígado, pulmón, ganglio linfático y páncreas; así como múltiples regiones cerebrales; incluyendo el cerebelo, el lóbulo parietal inferior, el giso temporal medio, la corteza occipital y el giso frontal superior; se compararon para evaluar la abundancia de circARN a través de tipos de tejidos. El análisis de los datos de ARN-seq generados utilizando seis herramientas diferentes de detección de ARN (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC y CIRCexplorer) reveló que un kit de preparación de la biblioteca de ARN total varado con pretratamiento RNase R y entrada de ARN de 4 g es el óptimo método para identificar el mayor número relativo de circRNAs. De acuerdo con los hallazgos anteriores, se observó el mayor enriquecimiento de los circRNAs en los tejidos cerebrales en comparación con otros tipos de tejidos.

Introducción

Los ARN circulares (ArnNA) son ARN endógenos y no codificantes que han ganado atención dada su expresión generalizada en el transcriptoma eucariota¹^,²^,³. Se forman cuando los exons se empalman entre sí y por lo tanto se consideraron inicialmente como artefactos de empalme⁴^,⁵. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los circRNAs exhiben tipo de célula, tejido y etapa específica del desarrollo expresión específica³^,⁶ y se conservan evolutivamente