Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Resumen

Este artículo describe un protocolo para la generación de células T CD8 específicas de antígenos, y su expansión in vitro, con el objetivo de producir un alto número de células T funcionales para su uso in vitro e in vivo.

Resumen

La diabetes tipo 1 (T1D) se caracteriza por una autoinmunidad específica de los islos que conduce a la destrucción de células beta y a la pérdida absoluta de la producción de insulina. En el modelo de ratón espontáneo de diabetes no obesa (NOD), la insulina es el objetivo principal, y la manipulación genética de estos animales para eliminar un único epítopo de insulina clave previene la enfermedad. Por lo tanto, la eliminación selectiva de células que presentan antígenos profesionales (AAP) que llevan este epítopo patógeno es un enfoque para inhibir las respuestas autoinmunes no deseadas específicas de insulina, y probablemente tiene un mayor potencial traslacional.

Los receptores de antígeno quimérico (CAR) pueden redirigir las células T a diana selectivamente los antígenos causantes de la enfermedad. Esta técnica es fundamental para los recientes intentos de utilizar la ingeniería celular para la terapia celular adoptiva para tratar múltiples cánceres. En este protocolo, describimos una transducción optimizada del retrovirus de células T (RV) y un protocolo de expansión in vitro que genera un alto número de células CD8 CAR-T específicas del antígeno funcional a partir de un bajo número de células ingenuas. Anteriormente se han descrito múltiples protocolos de células CAR-T, pero típicamente con una eficiencia de transducción relativamente baja y viabilidad celular después de la transducción. Por el contrario, nuestro protocolo proporciona hasta un 90% de eficiencia de transducción, y las células generadas pueden sobrevivir más de dos semanas in vivo y retrasar significativamente la aparición de la enfermedad después de una sola perfusión. Proporcionamos una descripción detallada del mantenimiento celular y el protocolo de transducción, para que los pasos críticos se puedan seguir fácilmente. Todo el procedimiento desde el aislamiento de células primarias hasta la expresión CAR se puede realizar en un plazo de 14 días. El método general se puede aplicar a cualquier modelo de enfermedad del ratón en el que se conozca el objetivo. Del mismo modo, la aplicación específica (dirigida a un complejo patógeno de péptido/clase II de MHC) es aplicable a cualquier otro modelo de enfermedad autoinmune para el que se haya identificado un complejo clave.

Introducción

Dado el riesgo probablemente reducido de efectos fuera del objetivo no deseados, las terapias inmunitarias específicas de antígenos (ASI) son tratamientos prometedores para enfermedades autoinmunes como la T1D. La acumulación de evidencia sugiere que las respuestas inmunitarias a (prepro)insulina pueden ser particularmente importantes en T1D¹. En la última década, estudios de múltiples grupos, incluido el nuestro, sugieren fuertemente que la presentación de un epítopo que contiene aminoácidos de cadena De insulina 9 a 23 por moléculas específicas de Clase II de MHC (B:9-23/MHCII), juega un papel importante en el desarrollo de T1D en ratones y h....

Protocolo

Los ratones se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos en una instalación transgénica de ratones, y todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de cuidado y uso de animales del Baylor College of Medicine.

NOTA: El experimento requiere preparar el virus y las células T en paralelo. La Tabla 1 resume el protocolo. Los reactivos y búferes clave se enumeran en la Tabla de materiales. Nos centramos en la generación y expansión de células CAR-T dirigidas a poblaciones específicas de AAP en este protocolo.

1.....

Resultados

Por lo general, la eficiencia de transducción mediante este protocolo es de 60-90 %. En el experimento mostrado en la Figura3, antes de ordenar aproximadamente, el 70% de las células T CD8 co-expresaron GFP. También expresaron CD28 y CD3 (Figura3C). Es importante destacar que todas las células GFP⁺ de "prueba" también co-teñidas con los tetrámeros IA^g7-B:R3, pero no con el tetrámero de control (Figura

Discusión

Este protocolo describe un método eficiente para producir células CD8 CAR-T específicas para antígenos por transducción retroviral. La eficiencia de transducción de nuestro protocolo es típicamente alta, y la expresión robusta de la CAR se observa generalmente. Las células T CAR expandidas conservan las características esenciales de las células T activadas por los padres, y la especificidad de los anticuerpos, y son adecuadas tanto para el uso in vitro como in vivo. Hemos aplicado células T Ab-CAR CD8 en la reprogramació.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Mercaptoetanol (50mM)	Gibco	21985-023	50 μ M
5' RACE PCR	Clontech	634859
anti-ratón CD28	eBioscience	14-0281-86	concentración final en 1µ g/ml
anti-ratón anti-ratón anti-CD3e	eBioscience	145-2C11	concentración final en 1µ g/ml
Biotina Rata Anti-Ratón IFN-& gamma;	BD Biosciences	554410	Concentración de trabajo a 0,5 y micro; g/ml
BSA	Sigma	A7030
Kit Maxi-Prep sin endo	Qiagen	12362
Gentamicin	Gibco	15750-060	Final 50 µ g/ml.
Hyclone	inactivado por calor	SH30087.03	Final 10%
FCS HEPES (100X)	Gibco	15630-080	1X
IAg7-CLIP tetrámero-BV421 Instalación de	tetrámero NIH en Emory	por aprobación	Concentración de trabajo a 6 y micro; g/ml
IAg7-insulina P8E tetrámero-BV421	Tetrámero de los NIH Instalación en Emory	por aprobación	Concentración de trabajo a 6 y micro; g/ml
Insulina-Transferrina-Selenio-Etanolamina (ITS 100x)	ThermoFisher	51500056	La concentración final es 1x
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
LS Columnas	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Tampón de separación	Miltenyi Biotec	130-091-221
Ratón CD8a+ Kit	de aislamiento de células TMiletenyi Biotec Inc	130-104-075
Ratón CD8a+ Kit de aislamiento de células T	Miltenyi Biotec	130-104-075
Opti-MEM medio	ThermoFisher	31985070
Penicilina-estreptomicina (5000U/ml)	ThermoFisher	15070063	50 U/ml
Células Phoenix-ECO	ATCC	CRL-3214
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
pMIG II	Addgene	52107
pMSCV-IRES-GFP II	Addgene	52107
Rata purificada Anti-ratón IFN-γ	BD Biosciences	551216	Concentración de trabajo en 3 y micro; g/ml
Tampón de lisis de glóbulos rojos	Sigma	R7767
RetroNectin	Takara	T100A	Concentración de trabajo a 50 & micro; g/ml en PBS
rhIL-2 (concentración de stock 105 UI/ul)	Peprotech	200-02	Concentración final a 200 UI/ml
rmIL-7 (concentración de stock 50ng/ul)	R& D	407-ML-005	Concentración final a 0,5 ng/ml
RPMI-1640	Gibco	11875-093
Filtros de células estériles	Fisher Scientific	22-363-548
Tryple	Gibco	12605-028

anticuerpos FCS