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Artículo de método

Síntesis jerárquica y programable de oligosacáridos de una olla

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DOI:

10.3791/59987

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6 de septiembre de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genomics Research Center, Academia Sinica, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 3Department of Chemistry, Scripps Research Institute, 4Institute of Information Science, Academia Sinica

En este artículo

Resumen

Este protocolo demuestra cómo utilizar el software Auto-CHO para la síntesis jerárquica y programable de oligosacáridos. También describe el procedimiento general para los experimentos de determinación de RRV y la glicosilación de una olla de SSEA-4.

Resumen

Este artículo presenta un protocolo experimental general para la síntesis de oligosacáridos de una olla programable y demuestra cómo utilizar el software Auto-CHO para generar soluciones sintéticas potenciales. El enfoque programable de síntesis de oligosacáridos de una olla está diseñado para potenciar la síntesis rápida de oligosacáridos de grandes cantidades utilizando bloques de construcción de tioglicósidos (BBL) con el orden secuencial adecuado de los valores de reactividad relativa (RRV). Auto-CHO es un software multiplataforma con una interfaz gráfica de usuario que proporciona posibles soluciones sintéticas para la síntesis de oligosacáridos de una olla programable mediante la búsqueda de una biblioteca BBL (que contiene alrededor de 150 bBL validados y >50.000 bBL virtuales) con RCV predichos con precisión mediante la regresión vectorial de soporte. El algoritmo para la síntesis jerárquica de un solo pozo se ha implementado en Auto-CHO y utiliza fragmentos generados por reacciones de un solo disco como nuevas BBB. Además, Auto-CHO permite a los usuarios dar comentarios para las BBB virtuales para mantener los valiosos para su uso posterior. En este trabajo se muestra la síntesis de una olla del antígeno embrionario 4 específico de la etapa (SSEA-4), que es un marcador de células madre embrionarias humanas pluripotentes.

Introducción

Los carbohidratos son omnipresentes en la naturaleza1,2, pero su presencia y modo de acción siguen siendo un territorio desconocido, principalmente debido al difícil acceso a esta clase de moléculas3. A diferencia de la síntesis automatizada de oligopéptidos y oligonucleótidos, el desarrollo de la síntesis automatizada de oligosacáridos sigue siendo una tarea formidable, y el progreso ha sido relativamente lento.

Para abordar este problema, Wong y otros desarrollaron el primer método automatizado para la síntesis de oligosacáridos utilizando un programa de software programable llamado Optimer4, que guía la selección de BBLs de una biblioteca de 50 BCL para Reacciones. Cada BBL fue diseñado y sintetizado con una reactividad bien definida ajustada por varios grupos de protección. Con este enfoque, las complejidades de la protección de la manipulación y la purificación intermedia se pueden minimizar durante la síntesis, que se han considerado los problemas más difíciles de superar en el desarrollo de la síntesis automatizada. A pesar de este avance, el método sigue siendo bastante restringido, ya que el número de BBLs es demasiado pequeño y el programa Optimer sólo puede manejar ciertos oligosacáridos pequeños. Para oligosacáridos más complejos que requieren más BBB y múltiples pasadas de reacciones de un solo disco y condensación de fragmentos, se ha desarrollado una versión actualizada del programa de software, Auto-CHO5.

En Auto-CHO, se han añadido más de 50.000 BL con reactividad definida a la biblioteca BBL, incluyendo 154 sintéticos y 50.000 virtuales. Estas BBL fueron diseñadas por aprendizaje automático basado en propiedades básicas, cambios químicos de RMN calculadas6,7y descriptores moleculares8,que afectan a la estructura y reactividad de las BBB. Con este programa actualizado y un nuevo conjunto de BBL disponibles, la capacidad de síntesis se expande, y como se ha demostrado, se pueden preparar rápidamente varios oligosacáridos de interés. Se cree que este nuevo desarrollo facilitará la síntesis de oligosacáridos para el estudio de sus funciones en diversos procesos biológicos y sus impactos en las estructuras y funciones de las glicoproteínas y glucólidos. También se cree que este trabajo beneficiará significativamente a la comunidad de la glucociencia, dado que este método está disponible para la comunidad investigadora de forma gratuita. La síntesis del marcador esencial de células madre embrionarias humanas, SSEA-45, se demuestra en este trabajo.

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Protocolo

1. Manipulación automática del software

  1. Instalación de Java Runtime Environment: asegúrese de que Java Runtime Environment (JRE) se ha instalado en el dispositivo. Si jRE se ha instalado, vaya al paso siguiente, "inicialización de software"; de lo contrario, descargue e instale JRE de acuerdo con el sistema operativo del usuario que se encuentra en: .
  2. Inicialización del software: vaya al sitio web de Auto-CHO en y descargue el software de acuerdo con el sistema operativo. Actualmente, Auto-CHO es compatible con Windows, macOS y Ubuntu. La última guía del usuario de PDF se proporciona en el sitio web de Auto-CHO.
    1. Para los usuarios de Windows, descomprima Auto-CHO_Windows.zip y haga doble clic en Auto-CHO.jar en la carpeta Auto-CHO_Windows para iniciar el programa.
      NOTA: El usuario necesita instalar software de descomprimido, como 7-Zip, que se encuentra en , para desempaquetar el archivo zip. El usuario también puede utilizar el comando java -jar Auto-CHO.jar para iniciar el programa mediante el símbolo del sistema de Windows.
    2. Para los usuarios de macOS, haga clic con el botón derecho en Auto-CHO.jar y elija Abrir para iniciar el programa.
    3. Para los usuarios de Ubuntu:
      1. Instale libcanberra-gtk con el siguiente comando:
        $ sudo apt-get install libcanberra-gtk*
      2. Cambiar el permiso de acceso de Auto-CHO_Ubuntu.sh:
        $ chmod 755 Auto-CHO_Ubuntu.sh
      3. Ejecute el programa Auto-CHO:
        $ ./Auto-CHO_Ubuntu.sh
  3. Introduzca la estructura glicana deseada. Elija dibujar una estructura de glicano o leer un archivo de estructura existente.
    1. Entrada por dibujo:
      1. Haga clic en Editar Glycan de GlycanBuilder9,10 (Figura 1, btn1; Figura 2A) o el área de Haga clic aquí para editar el destino sintético para dibujar y editar la estructura de consulta de GlycanBuilder. La información de vinculación y quiralidad no debe ignorarse. Haga clic en los botones Globo-H, SSEA-4u OligoLacNAc (Figura 1, ejemplos) para mostrar los ejemplos.
      2. Seleccione Archivo (File) ) Exportar a formatos de secuencia ? Exportar a GlycoCT condensado para guardar la estructura editada (opcional).
      3. Cierre el cuadro de diálogo GlycanBuilder para completar la edición.
    2. Entrada leyendo un archivo:
      1. Haga clic en Editar Glycan de GlycanBuilder (Figura 1, btn1; Figura 2A) o el área de Haga clic aquí para editar el destino sintético para editar la estructura de consulta.
      2. Seleccione Archivo (File) ) Importe desde formatos de secuencia para elegir el archivo de estructura de consulta con el formato correspondiente.
  4. Configuración de parámetros de búsqueda (opcional).
    1. Defina los parámetros de búsqueda en la pestaña " Configuración deparámetros" (Figura 1, pestaña2) para obtener resultados de búsqueda razonables.
      Nota:
      El umbral de RRV de clase alta debe ser un número real y 0.
      El umbral de RRV de clase media debe ser un número real y 0.
      Umbral de RRV de clase alta debe ser >Umbral de RRV de clase media.
      El número máximo de fragmentos debe ser un entero y el número 1.
      El número BBL mínimo en un fragmento debe ser un entero y entre 1 y 3.
      El número máximo de BBL en un fragmento debe ser un entero y entre 1 y 3.
      El número máximo de BBL en un fragmento debe ser el númeroBBL mínimo en un fragmento.
      Min Donor/Acceptor RRV Diferencia debe ser un número real positivo.
      La relación RRV de donante/aceptador mínimo debe ser un número real positivo.
      La relación RRV de donante/aceptador máximo debe ser un número real positivo.
      La relación RRV de donante/aceptador máximo debe ser > Relación RRV dedonante/aceptación mínima.
    2. Haga clic en el botón Aceptar para habilitar la nueva configuración.
  5. Seleccione la biblioteca de Building Block(Figura 1, tab5). La configuración predeterminada es buscar solo en la biblioteca experimental. Si desea buscar en las bibliotecas experimentales y virtuales, compruebe los pasos siguientes.
    1. Seleccione la pestaña Biblioteca de bloques de creación virtual(figura 2C, pestaña5). Los bloques de construcción experimentales y virtuales pueden trabajar juntos para mejorar la capacidad de búsqueda de Auto-CHO. Actualmente, Auto-CHO proporciona más de 50.000 bloques de creación virtuales con RRVs previstos en la biblioteca.
    2. Seleccione Usar bibliotecas experimentales y virtuales y aplique Filtrado para mostrar bloques de creación virtuales con determinados criterios. Haga clic en el botón Mostrar BBL(s) virtuales seleccionados (Figura 2C, btn5) para mostrar solo los bloques de creación virtuales seleccionados.
    3. Haga clic en el botón Mostrar BBL(s) virtuales filtrados (Figura 2C, btn6) para mostrar solo los bloques de creación virtuales con ciertos criterios definidos por el usuario.
    4. Haga clic en el botón Mostrar todos los BBL virtuales (Figura 2C, btn7) para mostrar todos los bloques de creación virtuales disponibles y restablecer el filtro.
    5. Compruebe uno o varios bloques de creación virtuales deseados que el usuario desea utilizar para la búsqueda.
  6. Seleccione la pestaña Estructura de consulta (figura 1, tab1) y haga clic en el botón Buscar biblioteca de bloques de creación(figura 1, btn2) para buscar las soluciones sintéticas de un solo depósito para la estructura de consulta. A continuación, confirme la configuración del parámetro.
  7. Busque en el visor de resultados.
    NOTA: El resultado de la búsqueda se muestra en la pestaña Visualización de resultados(Figura 1, tab6). Los aceptadores finales reductores de diferentes números de residuos se muestran en la columna Reducción del valido final(Figura 1, visor1).
    1. Seleccione un aceptador de extremo de reducción y las soluciones se muestran en la lista de soluciones sintéticas (figura 1, viewer2). Los fragmentos se muestran en la lista de fragmentos (figura 1, visor3) para sugerir cuántos fragmentos se deben utilizar en la síntesis.
      NOTA: El sistema proporciona información detallada de cada fragmento, incluido el RRV del fragmento, el rendimiento computacional, así como qué grupo de protección debe desprotegerse para el uso posterior del fragmento en la reacción de un solo depósito. Los bloques de creación utilizados para ensamblar el fragmento seleccionado se muestran en el visor4 de la Figura 1. El visor5 de la Figura 1 también muestra la información de conexión del fragmento.
    2. Ver y comprobar estructuras químicas e información detallada de los bloques de construcción seleccionados en las regiones de Estructura química de Building Block y Navegador de bloquesde construcción , respectivamente, para bloques de construcción experimentales(Figura 1, tab4).
  8. Salida del resultado de la búsqueda a texto (opcional).
    1. Seleccione la pestaña Texto de resultado (Figura 1, tab7).
    2. Haga clic en Guardar texto de resultado (figura 2B, btn4) y elija el destino del archivo de texto.
  9. Comentarios para bloques de creación virtuales (opcional).
    NOTA: Los comentarios se pueden dar en bloques de creación virtuales a través del cuestionario en línea. Los comentarios pueden ayudar a la comunidad a mantener bloques de creación virtuales útiles y eliminar los ineficaces.
    1. Seleccione la pestaña Building Block virtual (Figura 1, tab5).
    2. Haga clic en el enlace Para calificar del bloque de creación virtual del que desea calificar o comentar en la columna Comentarios.
    3. Rellene el formulario de comentarios después de que el sistema abra una página web y envíela.
      NOTA: No cambie el ID de BBL virtual.

2. Experimentos de determinación de RRV

  1. En un matraz de fondo redondo de 10 ml, combine los dos donantes de tioglicósidos (0,02 mmol de cada uno: Dr4 es el donante de referencia con RRV conocido; Dx1 es la molécula de donante de RRV desconocido), metanol absoluto (0,10 mmol) y terlito en diclorometano (DCM, 1,0 ml), luego revuelva a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
  2. Tomar una alícuota de esta mezcla (30 l) e inyectar la mezcla en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en tres inyecciones separadas (10 l para cada inyección). Mida el coeficiente (a) entre la absorción (A) y la concentración de la molécula del donante [D] en las condiciones de separación basal (acetato de éter/n-Hexano a 20/80).
  3. Añadir una solución de 0,5 M N-Iodosuccinimida (NIS) en acetonitrilo (40 l, 0,02 mmol) en la mezcla de reacción, seguido de la adición de una solución de ácido trifluorometanosulfónico de 0,1 M (TfOH) (20 l, 0,02 mmol), y revuelva la mezcla a RT durante 2 horas.
  4. Diluir la mezcla de reacción con DCM (4,0 ml), filtrar y lavar con tiosulfato sódico acuoso saturado que contiene 10% de carbonato de hidrógeno sódico (2x con 5 ml de volumen cada uno). Extraiga la capa acuosa con DCM (3x con 5 mL). Combinar toda la capa orgánica, lavarla con 5 ml de salmuera y secarla con aproximadamente 200 mg de sulfato de magnesio anhidro.
  5. Agitar suavemente la mezcla durante 30 s, filtrarla a través de un embudo con un papel de filtro acanalado para eliminar el sulfato de magnesio, luego recoger el filtrado en un matraz de fondo redondo de 25 ml. Retire el disolvente con un evaporador rotativo.
  6. Disolver el residuo en DCM (1,0 ml). Tomar una alícuota de esta mezcla (30 l) e inyectarla en HPLC en tres inyecciones separadas (10 l para cada inyección). Medir las concentraciones de los donantes restantes ([Dx] y [Dref]) por HPLC en las mismas condiciones de separación (acetato de éter/n-hexano a 20/80) (Aref)t a 24417,0, (Ax)t N.o 23546,3.
  7. Mida la reactividad relativa entre Dx1 frente a Dr4, kx1/kr4 a 0,0932. Según el valor de reactividad relativo de Dr4, el valor de reactividad relativo de Dx1 es 3.
    NOTA: aA /[D], (Aref)0 a 74530.1, (Ax)0 a 26143.0. k x/kref á (ln[Dx]t - ln[Dx]0)/(ln[Dref]t - ln[Dref]0) x]t - ln[Ax]0)/(ln[Aref]t - ln[Aref]0) a 0,0932.

3. Glicosilación de una olla de SSEA-4

  1. Coloque un matraz de fondo redondo de 10 ml al vacío, séquelo con llama y deje que el matraz se enfríe a RT mientras está todavía bajo vacío. Retire el tabique de goma para añadir una mezcla de disacárido 1 donante (38 mg, 1,1 eq., 0,057 mmol), el primer aceptador 2 (40 mg, 1,0 eq., 0,053 mmol) y una barra de agitación magnética recubierta de teflón en el matraz.
  2. Transfiera 100 mg de tamices moleculares en polvo 4o a un matraz de fondo redondo de 5 ml. Mantenga este matraz al vacío, séquelo con llamas y deje que el matraz se enfríe a RT mientras está todavía bajo vacío. Transfiera los tamices moleculares recién secos de 4o al primer matraz que contiene el material de partida.
  3. Transfiera 1 ml de DCM recién secado al matraz. Revuelva la mezcla de reacción durante 1 h a RT y luego colóquela a una temperatura de -40 oC. Transfiera el NIS (13 mg, 1,1 eq., 0,057 mmol) al matraz.
  4. Inyectar TfOH (34 l, 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 M en éter) en el matraz a través del tabique utilizando una jeringa de microvolumen a -40 oC. Seguir revolviendo a -40oC durante 3 h.
  5. Después de que el primer aceptador 2 esté casi consumido, inyectar la solución del aceptador 3 en DCM en el matraz a través del tabique.
  6. Calentar la mezcla de reacción hasta -20 oC y transferir NIS (19 mg, 1,6 eq., 0,083 mmol) al matraz. Inyectar TfOH (34 l, 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 M en éter) en el matraz a través del tabique a -20 oC. Seguir revolviendo a -20oC durante 3 h.
  7. Después de consumir el producto de la reacción del primer paso, saque la reacción inyectando dos equivalentes de amina trietilo. Retire los tamices moleculares a través de un embudo de filtro embalado con Celite, recoja el filtrado en un matraz de fondo redondo de 25 ml y lave aún más el filtro con 10 ml de DCM.
  8. Transfiera el filtrado a un embudo separador y lávelo con tiosulfato sódico acuoso saturado que contenga 10% de NaHCO3 (2x con 10 ml cada uno). Extraiga la capa acuosa con DCM (3x con 10 mL). Combine las capas orgánicas y lave la mezcla con salmuera (10 ml) y séquela añadiendo MgSO4anhidro. Filtrarlo y recoger el filtrado en un matraz de fondo redondo de 100 ml.
  9. Retire el disolvente con un evaporador rotativo. Disolver la mezcla bruta con aproximadamente 1 ml de DCM y cargarla encima del lecho de sílice. Eluir el producto con una mezcla de acetato de etilo y tolueno (EtOAc/tolueno, 1/4 a 1/2) y recoger las fracciones.
  10. Retire el disolvente con un evaporador rotativo. Secar el residuo a presión reducida para dar derivada SSEA-4 totalmente protegida 4 (74 mg, 50% basado en el aceptador 2) como espuma blanca.

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Resultados

El resultado de búsqueda Auto-CHO basado en la configuración de parámetros predeterminada indica que SSEA-4 se puede sintetizar mediante una reacción [2 + 1 + 3]. La Figura 3 muestra la captura de pantalla de software del resultado de búsqueda SSEA-4. Cuando se selecciona un aceptador final de reducción de trisacárido(Figura 3, etiqueta 1), el programa muestra cuatro soluciones potenciales para la consulta. La primera solución ti...

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Discusión

El software Auto-CHO fue desarrollado para ayudar a los químicos a proceder a la síntesis jerárquica y programable de una olla de oligosacáridos5. Auto-CHO fue construido por el lenguaje de programación Java. Es un software GUI y multiplataforma, que actualmente es compatible con Windows, macOS y Ubuntu. El software se puede descargar de forma gratuita para el sitio web de Auto-CHO en , y su código fuente con licencia MIT se puede acceder desde el GitHu...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por Academia Sinica, incluyendo el Programa de la Cumbre, Ministerio de Ciencia y Tecnología [MOST 104-0210-01-09-02, MOST 105-0210-01-13-01, MOST 106-0210-01-15-02] y NSF (1664283).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcetonitriloSigma-Aldrich75-05-8
Sulfato de magnesio anhidroSigma-Aldrich7487-88-9
Cerio molibdato de amonioTCIC1794
DiclorometanoSigma-Aldrich75-09-2
DrieritaSigma-Aldrich7778-18-9
Acetatode etiloSigma-Aldrich141-78-6
MetanolSigma-Aldrich67-56-1
Tamices moleculares 4 y Aring;Sigma-Aldrich
n-HexaneSigma-Aldrich110-54-3
N-YodosuccinimidaSigma-Aldrich516-12-1
Bicarbonato de sodioSigma-Aldrich144-55-8
Tiosulfato de sodioSigma-Aldrich10102-17-7
ToluenoSigma-Aldrich108-88-3
Ácido trifluorometanosulfónicoSigma-Aldrich1493-13-6

Referencias

  1. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochimica Et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  2. Sears, P., Wong, C. -H. Toward Automated Synthesis of Oligosaccharides and Glycoproteins. Science. 291 (5512), 2344-2350 (2001).
  3. Kulkarni, S. S., et al. “One-Pot” Protection, Glycosylation, and Protection-Glycosylation Strategies of Carbohydrates. Chemical Reviews. 118 (17), 8025-8104 (2018).
  4. Zhang, Z., et al. Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis. Journal of the American Chemical Society. 121 (4), 734-753 (1999).
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  8. Yap, C. W. PaDEL-descriptor: An open source software to calculate molecular descriptors and fingerprints. Journal of Computational Chemistry. 32 (7), 1466-1474 (2011).
  9. Ceroni, A., Dell, A., Haslam, S. M. The GlycanBuilder: a fast, intuitive and flexible software tool for building and displaying glycan structures. Source Code for Biology and Medicine. 2, 3(2007).
  10. Damerell, D., et al. The GlycanBuilder and GlycoWorkbench glycoinformatics tools: updates and new developments. Biological Chemistry. 393 (11), 1357-1362 (2012).

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