Artículo de método

Modulación de la localización subcelular Tau como herramienta para investigar la expresión de genes relacionados con enfermedades

DOI:

10.3791/59988

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20 de diciembre de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tau es una proteína neuronal presente tanto en el citoplasma, donde se une a los microtúbulos, como en el núcleo, donde ejerce funciones no convencionales, incluida la modulación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Aquí, describimos un método para investigar la función de Tau nuclear excluyendo cualquier interferencia proveniente de Tau citoplasma.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau es una proteína de unión a microtúbulos expresada en las neuronas y su principal función conocida está relacionada con el mantenimiento de la estabilidad citoesquelética. Sin embargo, la evidencia reciente indicó que Tau está presente también en otros compartimentos subcelulares, incluyendo el núcleo donde está implicado en la protección del ADN, en la transcripción del ARNR, en la movilidad de los retrotransposones y en la organización estructural de la Nucleolo. Recientemente hemos demostrado que El Tau nuclear está involucrado en la expresión del gen VGluT1, sugiriendo un mecanismo molecular que podría explicar el aumento patológico de la liberación de glutamato en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Hasta hace poco, la participación de Tau nuclear en la modulación de la expresión de genes diana ha sido relativamente incierta y ambigua debido a limitaciones técnicas que impidieron la exclusión de la contribución de Tau citoplasmático o el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear. Para superar esta incertidumbre, desarrollamos un método para estudiar la expresión de genes diana modulados específicamente por la proteína nuclear Tau. Empleamos un protocolo que combina el uso de señales de localización y el fraccionamiento subcelular, permitiendo la exclusión de la interferencia de las moléculas citoplasmáticas Tau. Más notablemente, el protocolo es fácil y se compone de métodos clásicos y confiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células y condiciones celulares.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las funciones de la proteína Tau en el núcleo han despertado un interés significativo en los últimos años, ya que se ha demostrado que está estrechamente asociada con los ácidos nucleicos1,2,3,4,5,6. De hecho, un estudio reciente en todo el genoma demostró que Tau une secuencias de ADN génicas e intergénicas in vivo7. Se ha sugerido un papel en la organización nucleolar8,9,10,11. Además, se ha propuesto a Tau participar en la protección del ADN contra el estrés oxidativo e hipertérmico5,10,12,13, mientras que Tau mutado se ha relacionado con la inestabilidad cromosómica y la aneuploidía14,15,16.

Hasta ahora, los desafíos en el estudio de las funciones de Tau en el compartimento nuclear seguían casi sin resolver debido a las dificultades para disección de la contribución específica de Tau nuclear de la contribución de Tau citoplasmático. Además, las funciones atribuidas a las moléculas Tau en el compartimento nuclear, hasta ahora, son sólo correlativas porque carecen de una demostración inequívoca de la implicación directa de las proteínas nucleares Tau. De hecho, la participación de Tau en la movilidad de los retrotransposonos o en la transcripción del ARNr o en la protección del ADN11,12,17,18,19 podría explicarse también por la contribución de Tau citoflásico o por el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear.

Aquí, proporcionamos un método que puede resolver este problema mediante la explotación de un procedimiento clásico para aislar el compartimento nuclear combinado con el uso de las construcciones Tau 0N4R etiquetadas con localización nuclear (NLS) o señales de exportación nuclear (NES). Este enfoque elimina los problemas complejos relacionados con posibles artefactos debido a la derrame de moléculas Tau del compartimiento citoplasmático. Además, las construcciones Tau-NLS y Tau-NES inducen el enriquecimiento o la exclusión de moléculas Tau del compartimiento nuclear, respectivamente, proporcionando controles positivos y negativos para la implicación de moléculas nucleares Tau en una función específica. El protocolo es técnicamente fácil y está compuesto por métodos clásicos y fiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células, diferenciadas o no, como las células cancerosas que reactivan la expresión Tau20,21. Además, podría aplicarse también a otras proteínas que están presentes tanto en el citoplasma como en el núcleo con el fin de diseccionar funciones biológicas relacionadas con diferentes compartimentos.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultivo celular

  1. Cultivo de células SH-SY5Y (línea celular de neuroblastoma humano, CRL-2266) en medio completo (medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada con 10% de suero bovino fetal [FBS], 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomícica). Mantener las células en una incubadora a 37oC y 5%co2. Cultivar células en placas de 10 cm y dividir cuando confluente.

2. Diferenciación celular

  1. Para diferenciar las células SH-SY5Y, el día después del revestimiento, agregue ácido retinoico (RA) de 10 m para completar el medio durante 5 días.
  2. El sexto día sustituye el medio por medio de diferenciación: DMEM/F-12 complementado con 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamina. No agregue FBS ni antibióticos.
  3. Cultivar las células en medio de diferenciación durante 3 días.

3. Clonación de construcciones quiméricas

  1. Generar la construcción Tau-NLS clonando mediante la digestión enzimática de restricción en el marco en el extremo 3' de la secuencia Tau 0N4R (383aa) el 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAGAAGAGAGAGAAAAGGAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGA-3'.
    NOTA: El 3xNLS en el extremo 3' de Tau se clona en el plásmido pCMV-Tau para la expresión de mamíferos explotando los sitios de restricción XhoI y BamHI en el sitio de multicloning (MCS).
  2. Generar la construcción Tau-NES mediante la clonación mediante la digestión enzimática de restricción en el marco en el extremo 3' de la secuencia Tau 0N4R (383aa) la secuencia NES: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGCTGGACTCGTACA-3'.
    NOTA: La NES en el extremo 3' de Tau es clonada en el plásmido pCMV-Tau para la expresión de mamíferos explotando los sitios de restricción EcoRI y BamHI en el MCS.
  3. Transforme la cepa DH5alpha E.coli con 100 ng de ADN de los pasos 3.1 o 3.2 y las células de placa en placas LB-Agar con 100 mg/ml de ampicilina. Dejar crecer durante la noche a 37oC.
  4. Escoge una sola colonia y pincha las células en 5 ml de LB con ampicilina. Dejar que las células crezcan a 37 oC en agitación durante la noche.
  5. Extraiga el plásmido con un miniprep de ADN(Tabla de Materiales)y secuencia para verificar las construcciones.
  6. Transforme la cepa DH5alpha E. coli con las construcciones de secuencia verificadas y las células de placa en placas de agar LB con ampicilina. Dejar crecer durante la noche a 37oC.
  7. Escoge una sola colonia y pincha las células en 5 ml de LB con ampicilina. Dejar que las células crezcan a 37oC en agitación durante 2 h.
  8. Ponga las células del paso 3.7 en 200 ml de LB con ampicilina. Dejar crecer durante la noche a 37oC.
  9. Peletizar las células a 3.500 x g durante 10 min a 4oC.
  10. Extraer plásmido con un maxiprep de ADN(Tabla de Materiales).

4. Transfección celular

  1. Semilla 400.000 células del paso 1.1 en placas de 6 pocillos o 20.000 celdas en diapositivas de cámara de 8 pocillos. Placa cuatro muestras: células de control que se deben transvenir con un vector vacío, células que se deben transfigurar con Tau sin etiquetar, células que se transcusarán con Tau-NLS y células que se deben transusar con Tau-NES.
  2. El día después de la sembración transfect 400 ng de ADN para cada pozo utilizando los lípidos catiónicos(Tabla de Materiales)en placas de 6 pocillos o 200 ng de ADN para cada pozo para diapositivas de cámara de 8 pocillos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    1. Incubar el ADN y los lípidos catiónicos por separado en 250 l (para placas de 6 pocillos) o 25 l (para diapositivas de cámara de 8 pocillos) de medio sérico reducido durante 5 minutos a RT. Luego combínalos para generar el complejo DE LÍpidos de ADN e incubar durante 20 min.
    2. Sustituya el medio de cultivo por 2 ml (para placas de 6 pocillos) o 250 l (para diapositivas de cámara de 8 pocillos) de medio de cultivo completo fresco. Añadir el complejo de lípidos de ADN a las células e incubar a 37 oC durante la noche.
  3. Alternativamente, ADN transfecto con el reactivo catiónico polietilenimina (PEI).
    1. Mezclar 2 g de ADN y 6 l de PEI con 200 ml de medio de cultivo completo (para cada pocal en placas de 6 pocillos), o 1 g de ADN y 3 s de PEI con 100 ml de medio de cultivo completo (para cada pocto en diapositivas de cámara de 8 pocillos) , vórtice e incubar durante 10 min a RT.
    2. Agregue la mezcla a las células y agregue 1,8 ml de medio de cultivo completo por pozo en placas de 6 pocillos o 150 ml de medio de cultivo completo por pozo en diapositivas de cámara de 8 pocillos para alcanzar el volumen de chapado.
  4. Cambie el medio al día siguiente de la transfección y añada los medios de diferenciación como se describe en el paso 2.2.

5. Inmunofluorescencia

  1. Retire el medio de cultivo y enjuague las células con 1 x PBS. Fijar las células con 100% metanol helado durante 3 minutos sin agitar. Retire la solución de fijación y lávela brevemente con 1 PBS.
  2. Permeabilizar con tensioactivo no iónico al 0,1% en 1x PBS durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Brevemente, lavar con 1pbS, 3 veces.
  3. Incubar células con tampón de bloqueo (0,1% Tween 20 y 1% BSA en PBS) durante 30 minutos a RT en un agitador orbital.
  4. Incubar con anticuerpos primarios apropiados (p. ej., anticuerpo anti-Tau13 monoclonal de ratón) diluido 1:500 en tampón de bloqueo durante la noche a 4 oC en un agitador orbital. Retire la solución de anticuerpos y lávela brevemente con 1 x PBS.
  5. Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con el fluoróforo (por ejemplo, anticuerpos antiratón de cabra conjugados a Alexa Fluor 633) diluido 1:500 en tampón de bloqueo durante 1 h en RT. Retire la solución de anticuerpos y lávese brevemente con 1x PBS 3 veces.
  6. Para manchar los núcleos, incubar con DAPI diluido 1:20,000 en tampón de bloqueo durante 10 minutos en RT. Lavar con 1x PBS 3 veces. Monte los cubreobjetos en una corredera utilizando un medio de montaje antidescolor.

6. Western Blot

  1. Para recoger el pellet celular del paso 4.4, retire el medio y lave las células con PBS. Incubar con 500 oC de trippsina al 0,1% durante 4 min a 37oC. Agregue un volumen igual de medio completo y vuelva a suspender celdas.
  2. Recoger las células en un tubo y centrifugar a 500 x g durante 5 min. Al final de la centrifugación retire cuidadosamente el sobrenadante. Añadir 1 ml de PBS, centrifugar a 500 x g durante 5 min y retirar cuidadosamente el sobrenadante. Almacene los gránulos celulares en hielo para su uso inmediato o congele a -80 oC para un almacenamiento a largo plazo.
  3. Para extractos de proteína total, incubar el pellet celular durante 30 minutos en hielo en tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glicerol, 1% octilphenoxi poli(etilenoxi)etanol, ramificado(Tabla de Materiales),10 mM EDTA) complementado con proteasa e inhibidores de la fosfatasa. De acuerdo con la abundancia del pellet, utilice de 50 a 100 l de tampón de lisis.
    1. Centrifugar el extracto a 16.000 x g durante 15 min. Recoger el sobrenadante y cuantificar la concentración de proteínas mediante cualquier ensayo de cuantificación estándar. Preparar las muestras de proteínas para el SDS-PAGE mezclando 20 g de proteínas con 5 s de tampón de Laemmli de 4x en un volumen total de 20 ml y hervir a 100 oC durante 5 min.
      NOTA: La muestra se puede almacenar a -20 oC.
  4. Para fraccionamientos subcelulares, resuspenda las células del paso 6.2 en medio completo y recoja 1 x 106 celdas por cada muestra. Centrífuga a 500 x g durante 10 min para obtener pellets celulares para los siguientes pasos.
    1. Para aislar los compartimentos subcelulares, fraccione de acuerdo con las especificaciones del kit. Para aislar cada fracción, incubar el pellet celular del paso 6.4 con el tampón correspondiente, centrífuga, recoger el sobrenadante y añadir el siguiente buffer al pellet como se describe en 6.4.1.1-6.4.1.5. Añadir en orden tampón de extracción citoplasmática, tampón de extracción de membrana, tampón de extracción nuclear, tampón de extracción nuclear complementado con 5 mM CaCl2 y 3 U/L de nucleasa microcócica y tampón de extracción citoesquelética.
      NOTA: Todos los tampones deben complementarse con inhibidores de la proteasa. Escalar volúmenes de búfer según el volumen del pellet de celda.
      1. Para aislar la fracción citosólica, incubar gránulos celulares en 100 ml de tampón de extracción citoplasmática helada suplementada con inhibidores de la proteasa a 4 oC con una mezcla suave durante 10 minutos. Centrifugar a 500 x g a 4 oC durante 5 min y transferir el sobrenadante a tubos preenfriados.
      2. Añadir 100 l de tampón de extracción de membrana helada suplementada con inhibidores de la proteasa al pellet del paso 6.4.1.1, e incubar a 4oC con una mezcla suave durante 10 min. Centrifuge a 3.000 x g a 4 oC durante 5 min y recoger el sobrenadante.
      3. Para la fracción nuclear soluble, agregue 50 ml de tampón de extracción nuclear complementado con inhibidores de la proteasa al pellet del paso 6.4.1.2 y al vórtice. Incubar a 4oC durante 30 min, centrifugar a 5.000 x g a 4oC durante 5 min, y recoger el sobrenadante.
      4. Para la fracción nuclear insoluble, agregue 50 l de tampón de extracción nuclear complementado con inhibidores de la proteasa, CaCl2 y nucleasa microcócica al pellet del paso 6.4.1.3 y vórtice. Incubar a 37oC durante 5 min y volver a vórtice. Centrifugar a 16.000 x g a RT durante 5 min y recoger el sobrenadante.
      5. Para la fracción citoesquelética, añadir 50 l de tampón de extracción citoesquelética complementado con inhibidores de la proteasa al pellet del paso 6.4.1.4, y vórtice. Incubar 10 min en RT. Centrifuge el tubo a 16.000 x g durante 5 min, recoger el sobrenadante y desechar el pellet.
        NOTA: Escale los volúmenes de búfer según el volumen de celda, como se indica en el protocolo del kit. Consulte el protocolo kit para obtener más detalles sobre el tiempo de incubación y centrifugación y la temperatura22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativamente, utilice cualquier método estándar30 que, mediante el uso de detergentes y mediante el aumento de la fuerza iónica y la velocidad de centrifugación, separa las fracciones citosólicas, las membranas unidas a membrana, las citoesqueléticas y las fracciones nucleares. Separe la fracción nuclear soluble y la fracción nuclear insoluble explotando los tampones de extracción nuclear estándar. La muestra se puede almacenar a -20 oC.
    2. Para el SDS-PAGE, añadir 7 l de tampón De 4x Laemmli a 20 s de fracciones subcelulares obtenidas de los pasos 6.4.1.1-6.4.1.5, hervir a 100 oC durante 5 min.
  5. Cargue muestras en un gel de acrilamida y realice electroforesis a una tensión constante de 120 V. Transfiera proteínas a la membrana de nitrocelulosa a 250 mA durante 90 min.
  6. Compruebe la electroforesis adecuada del gel proteico y la hinchazón exitosa incubando la membrana durante 5 minutos en la solución de tinción de Ponceau. Enjuague la membrana en agua destilada hasta que el fondo esté limpio. Retire la mancha si continúa lavándolo con la solución salina tamponada Tris con Tween 20 (TBST) durante 10 minutos en una coctelera.
  7. Incubar la membrana con solución de bloqueo (5% de leche en TBST) durante 1 h a RT en la coctelera. Lávese 3 veces con TBST durante 5 min.
  8. Hibridar la membrana con el anticuerpo primario en la solución de bloqueo (1% de leche en TBST) durante la noche a 4 oC. Lávese 3 veces con TBST durante 5 min.
  9. Hibridar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado hrP en solución de bloqueo durante 1 h en RT. Lavar 3 veces con TBST durante 5 min.
  10. Detectar la banda de proteínas utilizando quimioluminiscencia. Cuantificar la intensidad de las bandas Western Blot por ImageJ. Normalizar la expresión proteica en el producto de un gen de limpieza: histona H2B para la fracción soluble nuclear e insoluble, GAPDH para la fracción citoplasmática y para extractos totales.

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Resultados

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La estrategia utilizada para diseccionar el impacto del Tau nuclear en la expresión génica evitando la contribución de las proteínas tau citoflásmicas se ha representado en la Figura 1. Brevemente, las proteínas Tau etiquetadas con NLS o NES se acumulan o excluyen del compartimento nuclear, respectivamente. El efecto funcional de este desequilibrio es la alteración de la expresión génica medida como el producto del gen VGluT1.

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Describimos un método para medir el impacto de la proteína nuclear Tau en la expresión génica. Con este protocolo la contribución de Tau citoplasma es muy limitada. Los pasos críticos de este protocolo son los siguientes: la diferenciación de las células sh-SY5Y del neuroblastoma humano, el fraccionamiento subcelular y la localización de la proteína Tau en el compartimento nuclear.

En primer lugar, como se muestra en la sección de resultados representativos, la diferenciación de las células SH...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alexa Fluor 633 cabra anti-ratón IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
anti actina AnticuerpoBETHYL LABORATORIEA300-485Aanti-conejo WB 1:10.000
anti GAPDH AnticuerpoFitzgerald Industries International10R-G109aanti-ratón WB 1:10.000
anti H2BAnticuerpo Abcamab1790anti-conejo WB 1:15.000
anti Tau-13 AnticuerpoSanta Cruz Biotechnologysc-21796anti-ratón WB 1:1.000; IF 1:500
anti Tubulina alfa AnticuerpoThermo Fisher ScientificPA5-16891anti-ratón WB 1:5.000
anti VGluT1 AnticuerpoSigma-AldrichAMAb91041anti-ratón WB 1:500
BCA Kit de ensayo de proteínasEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
Bloqueador de grado de transferenciaBiorad 1706404Leche en polvo descremada
BOVIN ALBÚMINA SÉRICASigma-AldrichA4503-50g
cOmplete MiniRoche11836170001inhibidor de la proteasa
Criterion TGX 4-20% Libre de manchas, 10 pocillosBiorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
Águila modificada de Dulbecco's Euroclon de glucosa media bajaECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100mlpH = 8, 0,5 M
Suero fetal bovinoEuroclonEC50182L
glicerolSigma-AldrichG5516-500ml
Cabra anti-ratón IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2005WB 1:1.000
Cabra anti-conejo IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2004WB 1:1.000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlOctilfenoxi poli(etilenoxi)etanol
ImmobilonWestern MERCKWBKLS0500
Lab-Tech Portaobjetos de cámara 8 pocillos portaobjetos de vidrionunc177402
L-glutaminaEuroclonECB3000D100X
Lipofectamina 2000 reactivo de transfecciónThermo Fisher Scientific12566014 lípido catiónico
MetanolSigma-Aldrich322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM medio sérico reducidoGibco31985070
PEISigma-Aldrich40,872-7
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific1514012210,000 U/mL, 100 mL
Solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001inhibidor de la fosfatasa
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163Paso 3.10
Ácido retinoicoSigma-AldrichR2625-100mg
Kit de fraccionamiento de proteínas subcelulares para células cultivadasMembrana78840
Biorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833.920
TCS SP2 microscopio confocal de barrido láserLeicaN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500mlSurfactante no iónico
Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific 154000540.50%
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
Medio de montaje antidecoloración VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps Sistemasde purificación de ADNPromegaA1330Paso 3.5
de nitrocelulosa soportada Thermo Fisher Scientific

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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