Modulación de la localización subcelular Tau como herramienta para investigar la expresión de genes relacionados con enfermedades

Resumen

El tau es una proteína neuronal presente tanto en el citoplasma, donde se une a los microtúbulos, como en el núcleo, donde ejerce funciones no convencionales, incluida la modulación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Aquí, describimos un método para investigar la función de Tau nuclear excluyendo cualquier interferencia proveniente de Tau citoplasma.

Resumen

Tau es una proteína de unión a microtúbulos expresada en las neuronas y su principal función conocida está relacionada con el mantenimiento de la estabilidad citoesquelética. Sin embargo, la evidencia reciente indicó que Tau está presente también en otros compartimentos subcelulares, incluyendo el núcleo donde está implicado en la protección del ADN, en la transcripción del ARNR, en la movilidad de los retrotransposones y en la organización estructural de la Nucleolo. Recientemente hemos demostrado que El Tau nuclear está involucrado en la expresión del gen VGluT1, sugiriendo un mecanismo molecular que podría explicar el aumento patológico de la liberación de glutamato en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Hasta hace poco, la participación de Tau nuclear en la modulación de la expresión de genes diana ha sido relativamente incierta y ambigua debido a limitaciones técnicas que impidieron la exclusión de la contribución de Tau citoplasmático o el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear. Para superar esta incertidumbre, desarrollamos un método para estudiar la expresión de genes diana modulados específicamente por la proteína nuclear Tau. Empleamos un protocolo que combina el uso de señales de localización y el fraccionamiento subcelular, permitiendo la exclusión de la interferencia de las moléculas citoplasmáticas Tau. Más notablemente, el protocolo es fácil y se compone de métodos clásicos y confiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células y condiciones celulares.

Introducción

Las funciones de la proteína Tau en el núcleo han despertado un interés significativo en los últimos años, ya que se ha demostrado que está estrechamente asociada con los ácidos nucleicos^1,2,3,4,5,6. De hecho, un estudio reciente en todo el genoma demostró que Tau une secuencias de ADN génicas e intergénicas in vivo⁷. Se ha sugerido un papel en la organización nucleolar^8,9,

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Cultivo de células SH-SY5Y (línea celular de neuroblastoma humano, CRL-2266) en medio completo (medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada con 10% de suero bovino fetal [FBS], 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomícica). Mantener las células en una incubadora a 37oC y 5%_co2. Cultivar células en placas de 10 cm y dividir cuando confluente.

2. Diferenciación celular

1. Para diferenciar las células SH-SY5Y, el día después del revestimiento, agregue ácido retinoico (RA) de 10 m para completar el medio durante 5 días.

Resultados

La estrategia utilizada para diseccionar el impacto del Tau nuclear en la expresión génica evitando la contribución de las proteínas tau citoflásmicas se ha representado en la Figura 1. Brevemente, las proteínas Tau etiquetadas con NLS o NES se acumulan o excluyen del compartimento nuclear, respectivamente. El efecto funcional de este desequilibrio es la alteración de la expresión génica medida como el producto del gen VGluT1.

Discusión

Describimos un método para medir el impacto de la proteína nuclear Tau en la expresión génica. Con este protocolo la contribución de Tau citoplasma es muy limitada. Los pasos críticos de este protocolo son los siguientes: la diferenciación de las células sh-SY5Y del neuroblastoma humano, el fraccionamiento subcelular y la localización de la proteína Tau en el compartimento nuclear.

En primer lugar, como se muestra en la sección de resultados representativos, la diferenciación de las células SH.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 633 cabra anti-ratón IgG	Life Technologies	A21050	IF 1:500
anti actina Anticuerpo	BETHYL LABORATORIE	A300-485A	anti-conejo WB 1:10.000
anti GAPDH Anticuerpo	Fitzgerald Industries International	10R-G109a	anti-ratón WB 1:10.000
anti H2B	Anticuerpo Abcam	ab1790	anti-conejo WB 1:15.000
anti Tau-13 Anticuerpo	Santa Cruz Biotechnology	sc-21796	anti-ratón WB 1:1.000; IF 1:500
anti Tubulina alfa Anticuerpo	Thermo Fisher Scientific	PA5-16891	anti-ratón WB 1:5.000
anti VGluT1 Anticuerpo	Sigma-Aldrich	AMAb91041	anti-ratón WB 1:500
BCA Kit de ensayo de proteínas	Euroclone	EMPO14500
BDNF	Alomone Labs	B-250
Bloqueador de grado de transferencia	Biorad 1706404		Leche en polvo descremada
BOVIN ALBÚMINA SÉRICA	Sigma-Aldrich	A4503-50g
cOmplete Mini	Roche	11836170001	inhibidor de la proteasa
Criterion TGX 4-20% Libre de manchas, 10 pocillos	Biorad	5678093
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62247
DMEM/F-12	GIBCO	21331-020
Águila modificada de Dulbecco's Euroclon de glucosa media baja		ECM0060L
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8, 0,5 M
Suero fetal bovino	Euroclon	EC50182L
glicerol	Sigma-Aldrich	G5516-500ml
Cabra anti-ratón IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	WB 1:1.000
Cabra anti-conejo IgG-HPR	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004	WB 1:1.000
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I8896-50ml	Octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol
Immobilon	Western MERCK	WBKLS0500
Lab-Tech Portaobjetos de cámara 8 pocillos portaobjetos de vidrio	nunc	177402
L-glutamina	Euroclon	ECB3000D	100X
Lipofectamina 2000 reactivo de transfección	Thermo Fisher Scientific		12566014 lípido catiónico
Metanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1kg
Opti-MEM medio sérico reducido	Gibco	31985070
PEI	Sigma-Aldrich	40,872-7
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL, 100 mL
Solución salina tamponada con fosfato (Dulbecco A)	OXOID	BR0014G
PhosStop	Roche	4906837001	inhibidor de la fosfatasa
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163	Paso 3.10
Ácido retinoico	Sigma-Aldrich	R2625-100mg
Kit de fraccionamiento de proteínas subcelulares para células cultivadas	Membrana	78840
	Biorad	1620097
TC-Plate 6well	SARSTEDT	833.920
TCS SP2 microscopio confocal de barrido láser	Leica	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ml	Surfactante no iónico
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific 15400054		0.50%
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ml
Medio de montaje antidecoloración VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000
Wizard Plus SV Minipreps Sistemas	de purificación de ADNPromega	A1330	Paso 3.5

de nitrocelulosa soportada Thermo Fisher Scientific