El protocolo describe el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales con una mancha de gel de ADN disponible comercialmente, la adquisición de la serie time lapse de células etiquetadas en vivo mediante microscopía de iluminación estructurada de superresor resolución (SR-SIM) y el seguimiento automático del movimiento nucleoide.
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Artículo de método
Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo
En este artículo
Resumen
Resumen
Los nucleoides mitocondriales son partículas compactas formadas por moléculas de ADN mitocondrial recubiertas de proteínas. El ADN mitocondrial codifica los ARN, los ARN y varios polipéptidos mitocondriales esenciales. Los nucleoides mitocondriales se dividen y distribuyen dentro de la red mitocondrial dinámica que sufre fisión/fusión y otros cambios morfológicos. La microscopía de fluorescencia en vivo de alta resolución es una técnica sencilla para caracterizar la posición y el movimiento de un nucleoide. Para esta técnica, los nucleoides se etiquetan comúnmente a través de etiquetas fluorescentes de sus componentes proteicos, a saber, el factor de transcripción a (TFAM). Sin embargo, esta estrategia necesita sobreexpresión de una construcción etiquetada con proteínas fluorescentes, que puede causar artefactos (informados para TFAM) y no es factible en muchos casos. Los tintes orgánicos de unión al ADN no tienen estas desventajas. Sin embargo, siempre muestran manchas de ADN nucleares y mitocondriales, por lo que carecen de especificidad a los nucleoides mitocondriales. Al tener en cuenta las propiedades fisicoquímicas de estos tintes, seleccionamos una mancha de gel de ácido nucleico (SYBR Gold) y logramos el etiquetado preferencial de nucleoides mitocondriales en células vivas. Las propiedades del tinte, particularmente su alto brillo al unirse al ADN, permiten la cuantificación posterior del movimiento nucleocio mitocondrial utilizando series temporales de imágenes de iluminación estructurada de superresorción.
Introducción
Las moléculas circulares de ADN de 16,5 kbp constituyen el material genético de las mitocondrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs y 13 polipéptidos necesarios para los complejos de fosforilación oxidativa mitocondrial. ADN mitocondrial unido al factor de transcripción mitocondrial a (TFAM) y varias otras proteínas forman los nucleoides mitocondriales1,2,3,4. Los nucleoides mitocondriales se mueven y redistribuyen entre los componentes de la red mitocondrial5,6 durante su remodelación m....
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Protocolo
NOTA: Todas las líneas celulares mencionadas aquí se cultivaron en el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco alto de glucosa complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), glutamina, penicilina/estreptomicina y piruvato. Equilibrar todos los medios y suplementos que se utilizarán el día del etiquetado y la toma de imágenes calentándolos hasta 37 oC en una incubadora establecida en 5% de CO2. Todo el trabajo de cultivo celular, incluido el etiquetado, se lleva a cabo en condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar.
1. Etiquetado de celdas en vivo
- Un día antes del procedimiento de et....
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Resultados
Caracterización del etiquetado de células vivas con SG
En primer lugar, la distribución de SG en las células tras la incubación con el tinte en varias diluciones se caracterizó por microscopía confocal. Después de la incubación con altas concentraciones de SG o picoGreen, ambos tintes etiquetaron principalmente los núcleos y mostraron una tinción punctata en el citoplasma (Figura 1), de forma similar a los datos publicados para otro tinte .......
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Discusión
Hay varios componentes críticos en el protocolo: Para lograr el etiquetado preferencial del ADN mitocondrial, la concentración del tinte de unión al ADN durante la incubación debe mantenerse muy baja (por ejemplo, una dilución de 1:10.000 de un stock comercial típico), y el tiempo de incubación debe ser de 30 min. El tiempo de incubación nunca debe exceder 1 h. Se debe utilizar el tinte SYBR Gold; otros tintes de unión al ADN no son lo suficientemente brillantes como para generar una señal fuerte al etiquetarse a baja co.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen a Asifa Akhtar y Angelika Rambold (Instituto Max Planck de Inmunobiología y Epigenética) por proporcionar células de HeLa.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Elyra PS1 | Carl Zeiss | que contiene módulo para microscopía de iluminación estructurada de superresolución (SR-SIM) | |
| DMEM de alta glucosa | GIBCO/ThermoFisher | 31966021 | |
| plato ibidi de 35 mm, fondo de cristal | Ibidi Gmbh | 81158 | |
| ibidi microSlide de 8 pocillos, fondo de cristal | Ibidi Gmbh | 80827 | |
| Paquete de software de visualización y procesamiento de imágenes | Imaris 8.4.1 | Bitplane/Oxford Instruments | |
| iXon 885 | Andor Technologies | con sensor retroiluminado | |
| LSM880 Airyscan | Carl Zeiss | Microscopio confocal de barrido láser con detector de matrices | |
| Mitotracker CMXRos Red | ThermoFischer | M7512 | glóbulos rojos mitocondriales tinción |
| Mitotracker Deep Red FM | ThermoFischer | M22426 | rojo lejano tinción mitocondrial de células vivas |
| picoGreen | ThermoFischer | P7581 | tinción de ADN permeada |
| celular Plan Apochromat 100x/1.46 Objetivo de aceite | Carl Zeiss | ||
| SYBR Gold | ThermoFischer | S11494 | tinción de ADN permeable celular |
| Zen Black 2012 software | Carl Zeiss | Software de adquisición y procesamiento de imágenes |
Referencias
- Kaufman, B. A., et al. The mitochondrial transcription factor TFAM coordinates the assembly of multiple DNA molecules into nucleoid-like structures. Molecular Biology of the Cell. 18 (9), 3225-3236 (2007).
- Farge, G., et al.
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Reimpresiones y permisos
