Etiquetado específico de nucleoides mitocondriales para microscopía de iluminación estructurada de lapso de tiempo

Las moléculas circulares de ADN de 16,5 kbp constituyen el material genético de las mitocondrias, codificando 22 tRNAs, 2 rRNAs y 13 polipéptidos necesarios para los complejos de fosforilación oxidativa mitocondrial. ADN mitocondrial unido al factor de transcripción mitocondrial a (TFAM) y varias otras proteínas forman los nucleoides mitocondriales^1,2,3,4. Los nucleoides mitocondriales se mueven y redistribuyen entre los componentes de la red mitocondrial^5,6 durante su remodelación morfológica, fisión o fusión dependiendo de la fase del ciclo celular, el estrés y otros factores (revisados en Pernas et al.⁷). Además, el movimiento de los nucleoides mitocondriales, está implicado en la enfermedad eritemológica del lupus sistémico⁸ y puede desempeñar un papel en otras enfermedades. La microscopía de fluorescencia es una técnica sencilla para los estudios de células vivas de orgánulos, pero la técnica tiene una resolución de >200 nm, que es mayor que el tamaño de los nucleoides mitocondriales (100 nm^9,10,11,12). Este límite ha sido eludido por las técnicas denominadas "superresolución", como el agotamiento estimulado de las emisiones (STED) y la microscopía de localización de molécula única (SMLM)^13,,14. Hasta ahora, los nucleoides mitocondriales y otros ADN fueron imageados en células vivas mediante microscopía directa de reconstrucción óptica estocástica (dSTORM)¹⁵. El STED observó estructuras submitocondriales finas con posiciones correlacionadas con el ADNs en células vivas¹⁶. Sin embargo, estas técnicas de super resolución requieren una alta intensidad de iluminación, lo que causa efectos fototóxicos en las células vivas^17. Por lo tanto, la toma de imágenes de lapso de tiempo de nucleoides mitocondriales con resolución más allá del límite de difracción es un desafío. Para hacer frente a esto, utilizamos microscopía de iluminación estructurada de superror resolución (SR-SIM)¹⁸. SIM requiere una dosis de potencia de iluminación mucho menor que STED y SMLM^19. Además, a diferencia de las técnicas STED y SMLM, SIM permite imágenes tridimensionales multicolores (3D) directas, y no requiere propiedades fotofísicas particulares de los fluoróforos ni de la composición del búfer de imágenes^19.

La estrategia convencional para etiquetar nucleoides mitocondriales en células vivas es el etiquetado fluorescente de una proteína nucleoides mitocondrial, como TFAM²⁰. Sin embargo, en muchos casos, esta estrategia no es adecuada. Además, la sobreexpresión de TFAM con etiqueta de proteína fluorescente produce un artefacto grave²¹. El etiquetado del ADN con tintes orgánicos tiene ventajas sobre una estrategia basada en proteínas fluorescentes (FP). Los tintes orgánicos están libres de restricciones relacionadas con el etiquetado de FP: se pueden utilizar para cualquier tipo de células o tejidos y se pueden aplicar en cualquier momento de un experimento. Se han notificado imágenes celulares vivas de nucleoides mitocondriales con varios tintes de unión al ADN: DAPI^22,SYBR Green^23,Vybrant DyeCycle²⁴y picoGreen^15,,25,,26. Un inconveniente sustancial de la mayoría de los tintes de unión al ADN para el etiquetado nucleoide es que manchan todo el ADN dentro de la célula. Dirigir un tinte únicamente al ADN mitocondrial es altamente deseable. Para lograrlo, es necesaria una cuidadosa selección de un tinte que posea propiedades fisicoquímicas adecuadas. Se sabe que los tintes lipofílicos que poseen carga positiva deslocalizada, como la rhodamine 123, se acumulan en las mitocondrias vivas, que preservan su potencial de membrana negativo. Además, un tinte ideal para el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales debe unir el ADN con alta afinidad y emitir fluorescencia brillante al unirse al ADN. Teniendo en cuenta estos requisitos, ciertas cianinas son prometedoras (por ejemplo, picoGreen), pero el ADN nuclear está abundantemente manchado por estos tintes simultáneamente con ADN mitocondrial^15,,25,,26. El presente protocolo describe el etiquetado específico de nucleoides mitocondriales en células vivas con otro tinte de cianina, SYBR Gold (SG), y el seguimiento de los nucleoides en videos SIM de superrescronidad de lapso de tiempo. Además, las células vivas teñidas de SG pueden ser imágenes por cualquier tipo de microscopio fluorescente invertido (confocal, disco giratorio, epifluorescencia, etc.) adecuado para células vivas y equipado con una fuente de luz de 488 nm.

NOTA: Todas las líneas celulares mencionadas aquí se cultivaron en el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco alto de glucosa complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), glutamina, penicilina/estreptomicina y piruvato. Equilibrar todos los medios y suplementos que se utilizarán el día del etiquetado y la toma de imágenes calentándolos hasta 37 oC en una incubadora establecida en 5% de CO₂. Todo el trabajo de cultivo celular, incluido el etiquetado, se lleva a cabo en condiciones estériles bajo una campana de flujo laminar.

1. Etiquetado de celdas en vivo

1. Un día antes del procedimiento de etiquetado, cultivo 4 x 10⁵ células HeLa en 2 ml de medio en un plato de Petri de 35 mm con fondo de cristal #1,5. Se pueden utilizar portaobjetos con cámara de varios pozos, pero los volúmenes deben ajustarse proporcionalmente al volumen del pozo. Diluir la suspensión celular para tener aproximadamente 50.000 células/ml y semilla 2 ml de la suspensión celular en una placa Petri de 35 mm.
2. Preparar las siguientes diluciones de la solución de stock comercial SYBR Gold (SG): 1:5,000. Preparar Mitotracker Deep Red (mancha roja lejana) o Mitotracker CMXRos Rojo (mancha roja)(Tabla de Materiales;stock comercial diluido 1:2,000) en medio de cultivo libre de rojo fenol. Prepare las mismas diluciones de picoGreen que para SG.
   NOTA: Las soluciones descritas en el paso 1.2 son las soluciones de etiquetado 2x. Proteja todas las soluciones que contienen colorantes fluorescentes de la luz tanto como sea posible.
3. Lavar las células adherentes con 2 ml de PBS una vez. Añadir 1 ml de fenol medio de cultivo libre de rojo a la placa Petri de 35 mm. Para una corredera con cámara de 8 pocús, utilice un volumen igual a 1/2 de la capacidad total del pozo (por ejemplo, añada 125 l si la capacidad total del pozo es de 250 l).
4. Agregue 1 mLof la solución de etiquetado 2x preparada en la placa Petri de paso 1.2 a 35 mm. Para una corredera de cámara de 8 pozos, utilice un volumen igual a 1/2 de la capacidad total del pozo. Incubar las células durante 30 min a 37oC por debajo del 5% de CO₂.
   NOTA: No incubar las células con solución de etiquetado SG durante más de 1 h, ya que una incubación más larga provocará el etiquetado del ADN nuclear.
5. Aspirar cuidadosamente el medio que contiene los tintes fluorescentes y lavar las células una vez con PBS.
6. Añadir medio de cultivo de células libres de rojo fenol y mantener las células en la oscuridad en una incubadora de_CO2 a 37 oC hasta la toma de imágenes.
7. Imagen de células vivas en un microscopio SR-SIM equipado con una unidad de incubación (ver más abajo).

2. Adquisición de imagen SR-SIM

1. Instale una incubadora de la parte superior del escenario en la etapa del microscopio. Establezca la temperatura deseada y la concentración de_CO2 (p. ej., 37 oC y 5 % para las células de mamíferos) y manténgase caliente durante al menos 1 h antes de iniciar la adquisición de la imagen.
2. Encienda todos los componentes del microscopio SR-SIM, incluidos los láseres, y déjelos calentar durante al menos 1 h.
3. Elija un objetivo de inmersión de alta ampliación y alta apertura numérica (NA) (por ejemplo, aceite 100x 1.46 NA) recomendado para SR-SIM por el fabricante del microscopio.
4. Instale un portaobjetos con cámara o un plato de 35 mm con células etiquetadas (del paso 1.6) en la etapa del microscopio incubado.
5. Localice el área de interés de la muestra, preferiblemente con los oculares. Para lograr la mejor calidad de imagen SR-SIM, elija las células que están bien conectadas al vidrio.
6. Utilice una cámara de dispositivo acoplado de carga (EM-CCD) de electrones de alta gama con electrones de alta gama para adquirir imágenes SR-SIM.
7. Con el software de adquisición de imágenes, establezca una alta ganancia EM recomendada para la cámara utilizada (por ejemplo, 300).
8. Antes de adquirir la serie de lapso de tiempo para el seguimiento de nucleoides, adquiera una imagen SR-SIM de dos colores del mismo campo de visión: un canal para la tinción mitocondrial y otro para SG. Establezca el primer canal de color adecuado a la mancha mitocondrial utilizada (por ejemplo, para una mancha mitocondrial roja, ajuste la excitación a 633 nm o más y un filtro de emisión de paso largo de 650 nm). Para la señal SG, ajuste la excitación en 488 nm y un filtro de emisión de paso de banda de 500-550 nm.
9. Usando el software, establezca la potencia láser más baja posible para las líneas de tinción de 488 nm y rojo lejano.
   NOTA: Un ajuste típico es 1% de potencia de salida láser ajustada por un filtro sintonizable acousto-óptico (AOTF).
10. Si el microscopio SIM adquiere canales solo secuencialmente (configuración de una sola cámara), apague el canal de detección de manchas de color rojo lejano.
11. Establezca la adquisición de un único plano focal desactivando la adquisición de la pila Z desmarcando la caja de la pila Z en el software.
12. Establezca el menor tiempo de exposición posible de la cámara EM-CCD.
13. Establezca tres rotaciones de la cuadrícula en lugar de cinco rotaciones.
14. Para aumentar la velocidad de fotogramas, en la pestaña Adquisición del software, configure la cámara para que lea los datos solo desde el área central del sensor de la cámara en lugar de"Full Chip".
    NOTA: Por ejemplo, cambiar de leer un área de 1.000 x 1.000 píxeles de sensor completo a leer solo 256 x 256 píxeles permite una reducción en el tiempo de exposición de la cámara de 50 ms a 13,4 ms y el tiempo total de fotograma de 1,8 s a 1,2 s. Si sólo se lee una parte central del sensor de la cámara, entonces el campo de visión será muy pequeño para un objetivo de 63x o 100x que se utiliza normalmente para SR-SIM. Un tiempo de exposición más corto reducirá la relación señal-ruido de las imágenes.
15. Optimizar la potencia del láser y el tiempo de exposición de la cámara: adquiera imágenes bidimensionales SR-SIM (2D) de células etiquetadas a varios valores de potencia láser (por ejemplo, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%) y varios tiempos de exposición (por ejemplo, 13,4 ms, 25 ms, 50 ms).
16. Procesar los datasets SIM sin procesar (consulte el paso 3.1).
17. Elija tiempos de exposición de la cámara y potencia láser que produzcan imágenes SIM con puntos brillantes en las mitocondrias (es decir, los nucleoides) con pocos o ningún artefacto generado por el procesamiento de SIM. Inspeccione las áreas fuera de las mitocondrias (por ejemplo, 1% de potencia del láser de estado sólido de 488 nm y 25 ms de exposición de la cámara EM-CCD).
18. Inicie la adquisición de la serie de lapso de tiempo utilizando los ajustes optimizados en los pasos 2.15–2.17.

3. Procesamiento y análisis de datos

1. Procesar conjuntos de datos SIM sin procesar con el módulo de iluminación estructurado de un software adecuado (Tabla de materiales):seleccione la casilla De verificación Automático para los parámetros de procesamiento de SIM. Para el procesamiento automático de varios archivos, utilice la herramienta de procesamiento por lotes, anule la selección de Usar actual para lote, haga clic en Ejecutar lote y seleccione varios archivos para el procesamiento de SIM.
2. Convierta los conjuntos de datos de series temporales procesados por SIM a formato ims con el software de conversión de archivos Imaris (es decir, la versión correspondiente a la versión del software Imaris).
3. Abra un archivo convertido en el software (versión 8.4.1 o posterior) que tenga una licencia para el módulo De línea (o pista).
4. Inicie el asistente de creación "Spots"haciendo clic en el icono Agregar nuevos puntos. Se iniciará un asistente para la creación.
5. Elija la pestaña Create del asistente.
6. En el primer paso del asistente, haga clic en Rastrear puntos (con el tiempo) y continúe con el segundo paso del asistente.
7. Establezca Diámetro XY estimado en 0,1-0,15 m, haga clic en Resta de fondo y continúe con el tercer paso.
8. Ajuste el umbral en el filtro"Calidad"arrastrando la línea vertical en el histograma para que la mayoría de los nucleoides se detecten como "puntos", mientras que los artefactos no se detectan (es decir, los puntos detectados se marcan como bolas superpuestas en la imagen). Compruebe si este es el caso en cada fotograma y reajuste el umbral si es necesario. Continúe con el cuarto y luego hasta el quinto paso del asistente.
9. Elija el algoritmo de movimiento autoregresivo. Establezca Distancia máxima en 0,5 m. Establezca Tamaño máximo de separación en 0.
10. Mira cada fotograma de la serie temporal y comprueba si se dibujan pistas falsas y si se introducen espacios entre pistas (las pistas creadas por el asistente con la configuración actual se marcan instantáneamente como líneas superpuestas en la imagen). Ajuste "Distancia máxima" si es necesario. Continúe con el sexto paso del asistente. Elija el filtro Duración de la pista y establezca un umbral de 3 a 5 s.
11. Si los puntos o pistas detectados actualmente no son óptimos, vuelva a los pasos anteriores del asistente utilizando los botones de navegación (en la parte inferior de la ventana del asistente) necesarios para ajustar cualquier parámetro para la creación de puntos o pistas.
12. Cuando los parámetros ajustados permiten al software detectar todos los puntos y crear pistas correctamente, haga clic en el botón de navegación de flecha verde en el asistente para confirmar la creación de las pistas.
13. Extraiga las estadísticas de las pistas haciendo clic en la ventana del icono Estadísticas. Elija los parámetros estadísticos necesarios (pestañas Valores detallados y promedio en Estadísticas) y exporte los valores como archivos csv haciendo clic en el icono Unidad de disquete para cuantificación y visualización.
    NOTA: La velocidad máxima de la pista, la velocidad media de la pista, la longitud de la pista y el desplazamiento de la pista son ejemplos de parámetros que son importantes.
14. Si es necesario presentar o publicar el conjunto de datos de imagen, cree instantáneas o archivos de vídeo que representen la serie de lapso de tiempo con pistas superpuestas opcionalmente mediante las herramientas Instantánea o Animación.

4. Adquisición de imagen confocal

1. Instale una incubadora de la parte superior del escenario en la etapa del microscopio, establezca la temperatura deseada y la concentración de_CO2 (es decir, 37 oC y 5 % para las células de los mamíferos) y manténgase caliente durante al menos 1 h antes de iniciar la adquisición de la imagen.
2. Encienda todos los componentes de un microscopio de escaneo láser confocal, incluidos los láseres, y déjelos calentarse durante al menos 1 h.
3. Elija un objetivo de aumento medio a alto deseado y un muestreo espacial según los criterios de Nyquist.
4. Para el canal SG, ajuste la excitación en 488 nm y un rango de detección de 500-550 nm. Para el canal de tinción mitocondrial, ajuste a 561 nm y 570–630 nm de emisión para un tinte rojo, o 633 nm de excitación y >650 nm de emisión para un tinte rojo lejano.
5. Establezca la potencia láser más baja posible (normalmente 1% o menos) que permita la adquisición de las señales con ganancias del detector PMT de 700 mV.
6. Adquiera imágenes confocales de dos colores de las células, donde los nucleoides mitocondriales se detectan en el "canal SG" y las mitocondrias se detectan en el canal "rojo" o "rojo lejano".

Caracterización del etiquetado de células vivas con SG
En primer lugar, la distribución de SG en las células tras la incubación con el tinte en varias diluciones se caracterizó por microscopía confocal. Después de la incubación con altas concentraciones de SG o picoGreen, ambos tintes etiquetaron principalmente los núcleos y mostraron una tinción punctata en el citoplasma (Figura 1), de forma similar a los datos publicados para otro tinte de cianina cargado positivamente (es decir, picoGreen)15. Sin embargo, tras la incubación con SG a 1:10.000 dilución, aparecieron manchas débiles en los núcleos, mientras que en el citoplasma, observamos un patrón de manchas brillantes (Figura 1). Por otro lado, la incubación con tinte picoGreen diluido 1:10,000 produjo principalmente tinción nuclear. La señal SG era mucho más brillante que la de picoGreen en la misma concentración. Los datos mostraron que el SG es más adecuado para la toma de imágenes de ADN mitocondrial que otros tintes similares de unión al ADN.

Para confirmar que los puntos brillantes están localizados en las mitocondrias, manchamos las células vivas simultáneamente con SG y mancha mitocondrial roja. Este último es un tinte orgánico permeable celular cargado positivamente que se acumula en las mitocondrias de las células vivas. Tras la incubación con SG a las 1:10.000 y 1:50.000 diluciones, casi todas las tinciones SG ocurrieron en las mitocondrias, mientras que al etiquetar a las 1:500 y 1:1.000 diluciones, se produjo una tinción significativa de los núcleos y el citoplasma(Figura 2).

Además, caracterizamos el curso de tiempo de tinción de células vivas con SG por microscopía de lapso de tiempo (Figura 3). Las gráficas de intensidad de fluorescencia SG en las mitocondrias frente al tiempo (Figura 3B) sugirieron que después de 45 min, la tinción nucleoides estaba cerca de la saturación. Por lo tanto, recomendamos tiempos de incubación de 30–60 min.

Probamos cómo cambia la distribución intracelular SG tras la fijación y/o permeabilización de las células. La fijación (2% de paraformaldehído [PFA]) de las células manchadas en vivo causó una ligera redistribución del tinte al núcleo (Figura 4A,B). La permeabilización de las células fijas (0,1% Tritón X100) eliminó el patrón de puntos SG en las mitocondrias, y la tinción de los núcleos fue dominante (Figura 4C). Si el SG fue añadido a las células después de la fijación y la permeabilización, se distribuyó uniformemente a través del citoplasma y los núcleos (Figura 4D). Por lo tanto, las células etiquetadas SG se pueden fijar si es necesario, pero el tinte no es adecuado para protocolos que requieren permeabilización.

Seguimiento de SR-SIM de células vivas y nucleoides mitocondriales
Las células vivas costendidas con SG y una mancha mitocondrial roja(Tabla de materiales)fueron imágenes en 3D mediante una técnica SIM de superresorción. Al igual que en las imágenes confocales (Figura 2), los nucleoides mitocondriales aparecieron como puntos brillantes dentro de las mitocondrias (Figura 5A). Además, adquirimos una serie temporal de imágenes SIM 2D y rastreamos las posiciones de los nucleoides en una resolución más allá del límite de difracción. Inmediatamente antes de comenzar la serie temporal adquirimos pilas SIM 3D en el SG y los canales de tinción mitocondrial. Luego adquirimos una serie temporal en el canal SG solamente y rastreamos los nucleoides mitocondriales con el fin de cuantificar sus movimientos. La velocidad media de la pista fue de 0,042 m/s, y la velocidad instantánea máxima de la pista fue de 0,078 a 0,012 m/s. La mayoría de los nucleoides no desplazaron lejos de sus posiciones originales, pero mostraron movimientos aleatorios de corta distancia que probablemente se limitaban a la red mitocondrial, como sugiere una superposición de pistas en las imágenes mitocondriales (Figura 5B). Se produjeron pocos desplazamientos direccionales rápidos durante una serie temporal típica( Película 1).

Figura 1: Comparación del etiquetado de celdas vivas picoGreen y SG. Las células A549 fueron incubadas con picoGreen o SG en las diluciones indicadas y se fueron imagen. Campos de visión representativos de las celdas etiquetadas en el canal verde. LSM880 Airyscan FAST, objetivo 20x/aire, Barra de escala a 50 m. Secciones ópticas únicas. Los cuadrados blancos marcan las áreas que se muestran con un aumento más alto a la derecha de los campos de visión completos de 423 x 423 m. Para diluciones 1:1.000 y 1:2.000, las mismas imágenes se muestran en dos ajustes de brillo: los ajustes de brillo "predeterminados" optimizados para 1:10.000 dilución y los ajustes de "brillo reducido" ajustados para evitar la saturación del detector. Esta cifra ha sido modificada de Jevtic et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Localización SG en células vivas tras el etiquetado a diferentes concentraciones. Las células de HeLa se incubaron durante 30 min con una mezcla de 0,25 m de Mitotracker CMXRos Red y la dilución SG indicada. La solución fue reemplazada por DMEM, y las imágenes fueron adquiridas en un microscopio LSM880 Airyscan, objetivo de aceite 63x 1.4, con una adquisición secuencial de canales de color. Se muestran las rebanadas ópticas individuales Barra de escala a 10 m). Esta cifra ha sido modificada de Jevtic et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Células de HeLa durante el etiquetado con SYBR Gold (SG). En primer lugar, las células heLa vivas fueron etiquetadas con Mitotracker CMXRos Red y lavadas. SG (dilución final 1:10,000 en DMEM) se añadió a las células y se adquirió una serie de lapso de tiempo. Microscopio LSM880, objetivo de 63x 1.4 Objetivo de aceite, adquisición secuencial. Las pilas Z se adquirieron en cada momento. Se muestran las proyecciones de intensidad máxima. (A) Intensidades medias de fluorescencia SG a lo largo del tiempo en varias regiones de interés. (B) Campos de visión representativos que muestran las regiones de interés en las que se midió la fluorescencia SG (rectángulos de color). (C) Un campo de visión en varios momentos durante la incubación con SG. Una región cuadrada marcada con línea blanca se muestra en un aumento más alto en la columna derecha. Esta cifra ha sido modificada de Jevtic et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efecto de la fijación y permeabilización en la localización SG en las células. Las células de HeLa se tiñeron con SG (stock diluido 1:10,000) y Mitotracker CMXRos Red (0,25 oM) durante 30 min. Se adquirieron rebanadas ópticas individuales en un microscopio de disco giratorio; adquisición secuencial; barra de escala a 10 m. (A) Células HeLa vivas teñidas con SG. (B) Células HeLa vivas teñidas con SG y luego fijadas con 2% de PFA en PBS durante 30 min. (C) Células HeLa vivas teñidas con SG, luego fijadas con 2% de PFA en PBS durante 30 min y permeabilizadas con 0.1% Tritón X100 durante 15 min. En el panel inferior, se muestra la misma imagen, pero el brillo en el canal verde se establece más alto. (D) Células HeLa fijadas con 2% de PFA, permeabilizadas con 0.1% Tritón X100 durante 15 min, y luego teñidas con SG y Mitotracker CMXRos Red. Para adquirir las imágenes mostradas en (D), la ganancia de EMCCD de la cámara para el canal verde se redujo en un factor de 12 en comparación con A-C para evitar sobreexposición. Esta cifra ha sido modificada de Jevtic et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Seguimiento de nucleoides en imágenes SIM en vivo. Imágenes representativas de un campo de visión de las células manchadas SG. Parte inferior: la imagen SIM de dos colores tomada antes de la adquisición de la serie time lapse. Verde - Canal SG; magenta - canal mitotracker. Arriba: pistas nucleoides de una serie de tiempo SIM de 50 fotogramas en el canal SG (Película 1); tiempo de fotogramas a 1,8 s; seguimiento por el software Imaris 8.4.1. Las orugas están codificadas por colores por la velocidad máxima de la pista (m/s); Elyra PS.1, modo SIM, objetivo de 100x/1.46 Oil; Barra de escala a 10 m. Esta cifra ha sido modificada de Jevtic et al.27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película 1: Serie de lapso de tiempo SIM que muestra celdas representativas manchadas de SG. Barra de escala a 5 m. Los nucleoides mitocondriales detectados están marcados como esferas blancas. Las pistas se visualizan como "colas de dragón" (longitud de 8 fotogramas) y codificadas por colores de acuerdo con sus velocidades instantáneas máximas (la barra de color en la parte inferior derecha muestra las velocidades en m/s). Seguimiento y visualización de nucleoides mitocondriales por el software Imaris 8.4.1. Este video ha sido publicado en Jevtic et al.27. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).

Los autores no tienen nada que revelar.