Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Alien Balian; Javier Garcia Gonzalez; Nora Bastida; Khadija-Tul Kubra Akhtar; Baris A. Borsa; Frank  J. Hernandez

doi:10.3791/60005

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

7.7K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/60005

⸱

1 de noviembre de 2019

Alien Balian^*¹^,²^,³ , Javier Garcia Gonzalez^*¹^,²^,³ , Nora Bastida¹^,³ , Khadija-Tul Kubra Akhtar¹^,³ , Baris A. Borsa¹^,²^,³ , Frank J. Hernandez¹^,²^,³

¹Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, ²Wallenberg Centre for Molecular Medicine (WCMM), ³Nucleic Acids Technologies Laboratory (NAT-lab), Linköping University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con diferentes condiciones humanas, subyacentes a su potencial como biomarcador. La metodología de cribado modular y fácil de implementar presentada en este documento permite la selección de sondas específicas de ácido nucleico para aprovechar la actividad de nucleasa como biomarcador de enfermedades.

Resumen

Las nucleasas son una clase de enzimas que descomponen los ácidos nucleicos al catalizar la hidrólisis de los enlaces de fosfodiester que unen los azúcares ribosa. Las nucleasas muestran una variedad de funciones fisiológicas vitales en organismos procariotas y eucariotas, que van desde el mantenimiento de la estabilidad del genoma hasta la protección contra patógenos. La actividad de nucleasa alterada se ha asociado con varias condiciones patológicas, incluyendo infecciones bacterianas y cáncer. Con este fin, la actividad de nucleasas ha demostrado un gran potencial para ser explotada como un biomarcador específico. Sin embargo, un método de cribado robusto y reproducible basado en esta actividad sigue siendo altamente deseable.

En este documento, introducimos un método que permite el cribado de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico como sustratos, con el alcance de la diferenciación entre condiciones patológicas y saludables. Este método ofrece la posibilidad de diseñar nuevas bibliotecas de sondeos, con una especificidad cada vez mayor, de forma iterativa. Por lo tanto, se realizan múltiples rondas de cribado para refinar el diseño de las sondas con características mejoradas, aprovechando la disponibilidad de ácidos nucleicos modificados químicamente. El considerable potencial de la tecnología propuesta reside en su flexibilidad, alta reproducibilidad y versatilidad para el cribado de la actividad de nucleasa asociada con las condiciones de la enfermedad. Se espera que esta tecnología permita el desarrollo de herramientas de diagnóstico prometedoras con un gran potencial en la clínica.

Introducción

Las nucleasas son una clase de enzimas capaces de cortar los enlaces de fosfodiester que forman la estructura columna vertebral de las moléculas de ácido nucleico. La gran diversidad de nucleasas hace que su clasificación sea bastante difícil. Sin embargo, existen algunos criterios comunes utilizados para describir las nucleasas, como la preferencia de sustrato (ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN)), el sitio de escote (endonucleasas o exonucleasas) o la dependencia de iones metálicos, entre otros¹. Las nucleasas son enzimas catalíticas altamente conservadas que tienen funciones fundamentales en ambos organismos procariota....