Discriminción y mapeo de las transcripciones primarias y procesadas en mitocondrion de maíz utilizando una estrategia circular basada en RT-PCR

Summary

Presentamos una estrategia circular basada en RT-PCR combinando RT-PCR circular, RT-PCR cuantitativo, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5' y mancha norte. Este protocolo incluye un paso de normalización para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5', y es adecuado para discriminar y mapear las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en el mitocondrion de maíz.

Abstract

En las mitocondrias vegetales, algunas transcripciones en estado estacionario tienen 5' trifosfato derivado de la iniciación de la transcripción (transcripciones primarias), mientras que los otros contienen 5' monofosfato generado post-transcripción (transcripciones procesadas). Para discriminar entre los dos tipos de transcripciones, se han desarrollado varias estrategias, y la mayoría de ellas dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5'. Sin embargo, el trifosfato en la primaria 5' termini es inestable, y dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones. Para diferenciar y mapear sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas de forma estable en el mitocondrion de maíz, hemos desarrollado una estrategia circular basada en RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, tratamiento de polifoshpatase de ARN 5', cuantitativa RT-PCR (RT-qPCR) y Northern blot. Como mejora, esta estrategia incluye un paso de normalización de ARN para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5'.

En este protocolo, el ARN mitocondrial enriquecido es pretratado por la polifosfatasa de ARN 5', que convierte el triphsofato de 5' en monofosfato. Después de la circularización y la transcripción inversa, los dos CDNderivados derivados de ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5' se normalizan mediante el ARNm maduro de maíz 26S, que tiene un extremo procesado de 5' y es insensible a 5' polifosfatasa. Después de la normalización, las transcripciones primarias y procesadas se discriminan comparando los productos cRT-PCR y RT-qPCR obtenidos de los ARN tratados y no tratados. La transcripción termini se determina mediante clonación y secuenciación de los productos cRT-PCR, y luego verificada por Northern blot.

Mediante el uso de esta estrategia, se han determinado la mayoría de las transcripciones en estado estacionario en mitocondrion de maíz. Debido al complicado patrón de transcripción de algunos genes mitocondriales, algunas transcripciones en estado estacionario no se diferenciaron y/o mapearon, aunque se detectaron en una mancha del norte. No estamos seguros de si esta estrategia es adecuada para discriminar y mapear las transcripciones de estado estacionario en otras mitocondrias vegetales o en plastoides.

Introduction

En las mitocondrias vegetales, muchos ARN maduros y precursores se acumulan como múltiples isoformas, y las transcripciones de estado estacionario se pueden dividir en dos grupos basados en la diferencia en sus extremos de 5'^{1,2,3, 4}. Las transcripciones primarias tienen extremos de trifosfato de 5', que se derivan de la iniciación de la transcripción. Por el contrario, las transcripciones procesadas tienen 5' monofosfato generado por el procesamiento post-transcripción. La discriminación y el mapeo de los dos tipos de transcripciones son i....

Protocol

1. Primer diseño

1. Diseñar imprimadores específicos de genes para transcripción inversa (RT) utilizando el software de diseño de imprimación PCR (Tablade Materiales)basados en las reglas generales del diseño de imprimación¹⁷.
   NOTA: Los imprimadores RT son muy específicos para las transcripciones de destino, y generalmente están anclados en la parte de 5' de las secuencias de codificación (RNN maduros y ARN precursores), o 500-600 nt aguas abajo del extremo anticipado de 5' (18S y 26S rRNAs).
2. Diseñe pares de imprimaciones divergentes para amplificar las transcripciones circularizadas por cRT....

Results

Estimación de la eficiencia de la circularización del ARN mitocondrial

En un estudio anterior, se utilizaron ARN totales y mitocondriales para la cartografía cRT-PCR de transcripción mitocondrial termini en Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), y los dos tipos de ARN dieron resultados cartográficos similares^12. Inicialmente, también usamos ARN totales para el mapeo cRT-PCR.......

Discussion

En un estudio anterior, los ARN totales y mitocondriales del cultivo de suspensión celular de Arabidopsis se utilizaron para mapear la transcripción mitocondrial termini por cRT-PCR, y se obtuvieron resultados similares¹². Sin embargo, sólo el ARN mitocondrial enriquecido se utilizó para mapear la transcripción mitocondrial termini en muchos otros estudios^1,2,3,9

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido acético	Aladdin, China	A112880	Para preparar 1x tampón TAE
Termociclador Applied Biosystems 2720	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.		4359659 Termociclador para amplificación de PCR
Ácido ascórbico	Sigma-aldrich, EE. UU.	V900134	Para la preparación de tampón de extracción
Biowest Agarosa	Biowest, España	9012-36-6	Para resolver PCR productos y ARNs
Albúmina sérica bovina	Sigma-aldrich, EE. UU	A1933	Para la preparación de tampón de extracción
Azul de bromofenol	Sigma-aldrich, EE. UU	B8026	Para la preparación de tampón de carga para electroforesis en gel de agarosa y Northern blot
DEPC	Sigma-aldrich, EE. UU	V900882	Desactivación de RNasa
DIG Kit de inicio del norte	Roche, EE. UU	.12039672910	Para el marcaje de DIG-RNA y Northern blot. Este kit contiene los reactivos para la transcripción-marcaje de ARN con DIG y ARN polimerasa T7, hibridación y detección quimioluminiscente.
EDTA	Sigma-aldrich, EE. UU	V900106	Para la preparación de tampón de extracción y 1x tampón TAE
EGTA	Sigma-aldrich, EE. UU	E3889	Para la preparación del tampón de lavado
Sistema de documentación de gel	Bio-Rad, EE. UU	Gel Doc XR+	Para obtener imágenes del gel de agarosa Glicerol
Sigma-aldrich, EE. UU	G5516	Para la preparación del tampón de carga para la electroforesis en gel de agarosa
GoldView II (5,000x)	Solarbio,. China	G8142	Tinción de ADN
Hybond-N +, membrana de nailon	Amersham Biosciences, EE. UU	RPN119	Para Northern blot
Image Lab	Bio-Rad, EE. UU	Image Lab 3.0	Gel de imagen, y compare la abundancia de productos de PCR.
KH2PO4	Sigma-aldrich, EE. UU	V900041	Para la preparación del tampón de extracción
KOH	Aladdin, China	P112284	Para la preparación del tampón de extracción
L-cisteína	Sigma-aldrich, EE. UU.	V900399	Para la preparación del tampón de extracción
Millex	Millipore, EE. UU	SLHP033RB	Para la extracción estéril y tampones de lavado por filtración
Miracloth	Calbiochem, EE. UU	475855-1R	Para filtrar los tejidos del grano molido
MOPS	Sigma-aldrich, EE. UU	V900306	Para la preparación de tampón de funcionamiento para Northern blot
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	2000C	Para el ensayo de concentración y pureza de ARN
NaOH	Sigma-aldrich, EE. UU	V900797	para preparación del tampón de lavado
pEASY-Blunt vector de clonación simple	TransGen Biotech, China	CB111	Clonación de la banda recuperada con gel. Contiene un promotor T7 varios bps aguas arriba del sitio de inserción.
ADN polimerasa de superfidelidad Phanta max	Vazyme, China	P505	ADN polimerasa para amplificación por PCR
Polivinilpirrolidona 40	Sigma-aldrich, EE. UU.	V900008	Para la preparación de tampón de extracción
Primer Premier 6.24	PREMIER Biosoft, EE. UU	Primer Premier 6.24	Para diseñar cebadores para la transcripción inversa y la amplificación por PCR
Transcriptasa inversa PrimeScript II	Takara, Japón	2690	Para sintetizar la primera hebra de ADNc
PureLink RNA Mini kit	Thermo Fisher Scientific, EE. UU.	12183025	Para la purificación de ARN
ARN 5' polifosfatasa	Epicentre, EE. UU.	RP8092H	Para convertir el trifosfato 5' en un
inhibidor de la ARNasa	monofosfato New England Biolabs, Reino Unido	M0314	Componente de la autoligadura del ARN y de las reacciones de tratamiento con la polifosfatasa 5', y se utiliza para inhibir la actividad de la ARNasa.
Acetato de sodio	Sigma-aldrich, EE. UU.	V900212	Para la preparación de tampón de funcionamiento para Northern blot
Cloruro de sodio	Sigma-aldrich, EE. UU	V900058	Para preparar 20x SSC
SsoFas supermezclas evaGreen Bio-Rad	, EE. UU	1725202	para RT-qPCR
T4 ARN ligasa 1	Nueva Inglaterra Biolabs, Reino Unido	M0437	Para la circularización de ARN
Tetrasódico pirofosfato	Sigma-aldrich, EE. UU.	221368	Para la preparación del kit de
purificación TIANgel midi	Tiangen Biotech, China	DP209	Para purificar fragmentos de ADN de gel de agarosa
Tris	Aladdin, China	T110601	Para preparar 1x tampón TAE
Reactivo TRIzol	Invitrogen, EE. UU		. 15596026 Para extraer ARN mitocondiral.
Kit universal de purificación de ADN	Tiangen Biotech, China	DP214	Para recuperar plastmidas linealizadas de la reacción de digestión de la enzima de restricción
Xileno cianol FF	Sigma-aldrich, EE. UU	X4126	Para la preparación de tampón de carga para la electroforesis en gel de agarosa