Presentamos una estrategia circular basada en RT-PCR combinando RT-PCR circular, RT-PCR cuantitativo, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5' y mancha norte. Este protocolo incluye un paso de normalización para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5', y es adecuado para discriminar y mapear las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en el mitocondrion de maíz.
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Artículo de método
Discriminción y mapeo de las transcripciones primarias y procesadas en mitocondrion de maíz utilizando una estrategia circular basada en RT-PCR
En este artículo
Resumen
Resumen
En las mitocondrias vegetales, algunas transcripciones en estado estacionario tienen 5' trifosfato derivado de la iniciación de la transcripción (transcripciones primarias), mientras que los otros contienen 5' monofosfato generado post-transcripción (transcripciones procesadas). Para discriminar entre los dos tipos de transcripciones, se han desarrollado varias estrategias, y la mayoría de ellas dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5'. Sin embargo, el trifosfato en la primaria 5' termini es inestable, y dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones. Para diferenciar y mapear sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas de forma estable en el mitocondrion de maíz, hemos desarrollado una estrategia circular basada en RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, tratamiento de polifoshpatase de ARN 5', cuantitativa RT-PCR (RT-qPCR) y Northern blot. Como mejora, esta estrategia incluye un paso de normalización de ARN para minimizar la influencia del trifosfato inestable de 5'.
En este protocolo, el ARN mitocondrial enriquecido es pretratado por la polifosfatasa de ARN 5', que convierte el triphsofato de 5' en monofosfato. Después de la circularización y la transcripción inversa, los dos CDNderivados derivados de ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5' se normalizan mediante el ARNm maduro de maíz 26S, que tiene un extremo procesado de 5' y es insensible a 5' polifosfatasa. Después de la normalización, las transcripciones primarias y procesadas se discriminan comparando los productos cRT-PCR y RT-qPCR obtenidos de los ARN tratados y no tratados. La transcripción termini se determina mediante clonación y secuenciación de los productos cRT-PCR, y luego verificada por Northern blot.
Mediante el uso de esta estrategia, se han determinado la mayoría de las transcripciones en estado estacionario en mitocondrion de maíz. Debido al complicado patrón de transcripción de algunos genes mitocondriales, algunas transcripciones en estado estacionario no se diferenciaron y/o mapearon, aunque se detectaron en una mancha del norte. No estamos seguros de si esta estrategia es adecuada para discriminar y mapear las transcripciones de estado estacionario en otras mitocondrias vegetales o en plastoides.
Introducción
En las mitocondrias vegetales, muchos ARN maduros y precursores se acumulan como múltiples isoformas, y las transcripciones de estado estacionario se pueden dividir en dos grupos basados en la diferencia en sus extremos de 5'1,2,3, 4. Las transcripciones primarias tienen extremos de trifosfato de 5', que se derivan de la iniciación de la transcripción. Por el contrario, las transcripciones procesadas tienen 5' monofosfato generado por el procesamiento post-transcripción. La discriminación y el mapeo de los dos tipos de transcripciones son importantes para desentrañar los mecanismos moleculares subyacentes a la transcripción y la maduración final de la transcripción.
Para distinguir entre las transcripciones primarias y procesadas en el mitocondrion vegetal, se han desarrollado cuatro estrategias principales. La primera estrategia es pretratar los ARN mitocondriales con pirofosfatasa de ácido tabaco (TAP), que convierte el trifosfato de 5' en monofosfato y permite que las transcripciones primarias sean circularizadas por ARN ligatado. Las abundancias de transcripción de muestras de ARN tratadas con TAP y no tratadas se comparan entonces por la amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) o RT-PCR circular (cRT-PCR)2,3,4. En la segunda estrategia, las transcripciones procesadas se agotan en primer lugar de los ARN mitocondriales utilizando exonucleasa dependiente del terminador 5'-fosfato (TEX), y las transcripciones primarias que quedan se mapean mediante el análisis de extensión de imprimación5,6 . La tercera estrategia es pre-tapar las transcripciones primarias usando guanylyl transferasa, y luego la posición de trifosfato 5' termini se determina mediante la extensión de imprimación junto con el análisis de protección de la nucleasa S17,8 ,9. A diferencia de las que dependen de la presencia/ausencia de trifosfato de 5', la cuarta estrategia combina transcripción in vitro, mutagénesis dirigida por el sitio y análisis de extensión de imprimación para caracterizar a los promotores putativos y determinar la transcripción sitiosdeiniciación 8,10,11. Mediante el uso de estas estrategias, se han determinado muchas transcripciones primarias y procesadas en las mitocondrias vegetales.
Sin embargo, varios estudios han informado de que el trifosfato de 5' de transcripciones primarias eran inestables, y se convirtieron fácilmente en monofosfato por razón desconocida2,4,12,13. Este problema dificulta una clara discriminación de los dos tipos de transcripciones mediante el uso de técnicas en función de la presencia/ausencia de trifosfato de 5', y esfuerzos anteriores para discriminar sistemáticamente entre las transcripciones primarias y procesadas en la planta mitocondrias falló2,12.
En este protocolo, combinamos cRT-PCR, tratamiento de polifosfatasa de ARN 5', RT-qPCR y Northern blot para distinguir sistemáticamente las transcripciones primarias y procesadas acumuladas establemente en maíz (Zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR permite el mapeo simultáneo de 5' y 3' extremidades de una molécula deARN, y generalmente se adapta a la transcripción de mapa termini en plantas 2,12,14,15. ARN 5' polifosfatasa podría eliminar dos fosfatos de la trifosfato 5' termini, lo que hace que las transcripciones primarias estén disponibles para la auto-ligación por ARN ligasa. Estudios anteriores mostraron que el ARNm maduro 26S en el maíz había procesado 5' terminus, y era insensible al ARN 5' polifosfatasa1,16. Para minimizar la influencia del trifosfato inestable en los 5' termini primarios, los ARN tratados con polifosfatasa y no tratados de 5' se normalizan mediante arNM maduros de 26S, y las transcripciones primarias y procesadas se diferencian comparando las cRT-PCR obtenidos de las dos muestras de ARN. Los resultados de la asignación cRT-PCR y la discriminación son verificados por Northern blot y RT-qPCR, respectivamente. Por último, se utilizan imprimaciones alternativas para amplificar las transcripciones detectadas en Northern blot pero no por cRT-PCR. Mediante el uso de esta estrategia basada en cRT-PCR, la mayoría de las transcripciones de estado estacionario en mitocondrion de maíz se han diferenciado y mapeado1.
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Protocolo
1. Primer diseño
- Diseñar imprimadores específicos de genes para transcripción inversa (RT) utilizando el software de diseño de imprimación PCR (Tablade Materiales)basados en las reglas generales del diseño de imprimación17.
NOTA: Los imprimadores RT son muy específicos para las transcripciones de destino, y generalmente están anclados en la parte de 5' de las secuencias de codificación (RNN maduros y ARN precursores), o 500-600 nt aguas abajo del extremo anticipado de 5' (18S y 26S rRNAs). - Diseñe pares de imprimaciones divergentes para amplificar las transcripciones circularizadas por cRT-PCR.
NOTA: Las imprimaciones divergentes emparejadas flanquean la unión de 5'-3' de las transcripciones circularizadas, y sus posiciones varían entre las transcripciones de destino analizadas (Figura S1). Algunas transcripciones tienen TOR larga; por ejemplo, nad2-1 5' UTR y rps4-1 3' UTR son 1,985 y 1,826/1,834 nt, respectivamente1. Si ambos imprimadores están anclados en la región de codificación, será difícil amplificar las transcripciones de destino. Por el contrario, algunas UTR son cortas; por ejemplo, los 3' UtRs de nad2-1 y nad4-1 son 34/35 y 29–31 nt, respectivamente1. Si las imprimaciones emparejadas se encuentran lejos de las secuencias de codificación, el PCR fallará. Generalmente, dos pares de imprimaciones divergentes están diseñados para cada transcripción objetivo, mientras que varios pares pueden ser necesarios para mapear aquellos cuyos patrones de transcripción son complicados y / o UT son muy largos. - Diseñe pares de imprimaciones convergentes para preparar sondas de ARN para la mancha del norte.
NOTA: Las imprimaciones emparejadas se encuentran en la región de codificación del gen objetivo, y el tamaño del producto PCR debe estar en el rango de 100 a 1.000 bp. Cada imprimación directa debe contener un sitio de enzimas de restricción para minimizar las secuencias vectoriales en las sondas resultantes.
2. Preparación de mitocondrion crudo a partir de núcleos en desarrollo de maíz
- Esterilice plagas, morteros, embudos de vidrio, tubos y puntas por autoclave, y séquelos en el horno.
- Realice todos los procedimientos a 4 oC o sobre hielo, y enfríe previamente todas las soluciones.
- Preparar 100 ml de tampón de extracción (EB), compuesto por sacarosa de 0,3 M, pirofosfato de tetrasodio de 5 mM, 10 mM KH2PO4,2 mM EDTA, 1% [w/v] polivinilpirrolidona 40, 1% [p/v] albúmina sérica bovina, 5 mM de L-cisteína y ácido ascórbico de 20 mM. Ajuste a pH 7.3 con KOH y esterilizar por filtración.
- Preparar 100 ml de tampón de lavado (WB) que consiste en sacarosa de 0,3 M, EGTA de 1 mM y MOPS de 10 mM (3-(N-morpholino)ácido propanesulfónico). Ajustar a pH 7.2 con NaOH y esterilizar por filtración.
NOTA: Se sugiere preparar EB y WB utilizando H2O desionizado tratado con DEPC. - Recoger 20 g de núcleos en desarrollo a los 11-20 días después de la polinización (DAP) a un tubo de 50 ml colocado en hielo, y luego transferir los granos a morteros pre-enfriados.
NOTA: Utilice una proporción de 100 ml de EB a 20 g de granos de maíz. - Agregue entre 10 y 20 ml de EB helado a cada mortero y muele los granos por completo.
- Agregue más EB y filtre los tejidos molidos a través de dos capas de tela de filtro (Tablade materiales).
- Centrifugar el filtrado a 8.000 x g durante 10 min y desechar el pellet.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y centrifugarlo a 20.000 x g durante 10 min.
- Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 6 ml WB.
- Alísgue la suspensión a cinco tubos libres de RNase de 1,5 ml, y centrifugarlos a 14.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante, congele el pellet mitocondrial en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 oC.
3. Extracción de ARN mitocondrial
- Extraiga el ARN mitocondrial con un reactivo comercial (Tablade Materiales)de acuerdo con las instrucciones de fabricación.
PRECAUCION: Este reactivo contiene isotiocianato de fenol y guanidina. Trabaje con él en una capucha de humos, y use abrigo de laboratorio y guantes. - Disolver el ARN mitocondrial aislado en H2O desionizado tratado con DEPC, y estimar la concentración y pureza del ARN con un espectrofotómetro (Tablade materiales).
NOTA: Por lo general, el ARN mitocondrial de 250 g se obtiene a partir de 20 g de granos de maíz 15-DAP. - Preparar un gel de agarosa compuesto por 1 tampón TAE (40 mM Tris, 20 mM de ácido acético, 1mM EDTA), 1,5% de agarosa (Tablade materiales)y 1x tinte de tinción nuclear (Tablade materiales).
- Agregue un volumen apropiado de tampón de carga 10x (0,5% de azul bromofenol, 0,5% de xileno cianol FF y 50% glicerol), y cargue la mezcla de ARN mitocondrial/tampón de carga en el gel de agarosa del 1,5%.
- Ejecute el gel en 1 tampón TAE a 5-6 V/cm durante 20–25 min, y evalúe la integridad del ARN mitocondrial mediante imágenes del gel con un sistema de documentación de gel (Tablade materiales).
NOTA: La presencia de dos bandas distintas (3.510 y 1.970 nt para el maíz mitocondrial 26S y 18S rRNA, respectivamente) es un estándar aceptable para el ARN mitocondrial intacto. Para excluir la posible degradación, se debe investigar la integridad del ARN durante los múltiples pasos de la preparación circular del ARN (Figura2).
4. Arn 5' Tratamiento de polifosfatasa
- Configurar el tratamiento de la polifosfatasa de ARN 5' (Tabla y Materiales) (Tabla 1), e incubar a 37 oC durante 30-60 min.
- Recuperar el ARN tratado con polifosfatasa de 5' con un kit de purificación de ARN (Tablade Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Repita los pasos 3.3 a 3.5.
5. Circularización del ARN
- Preparar dos reacciones de circularización utilizando las mismas cantidades de 5' ARN mitocondriales tratados con polifosfatasa y no tratados (Tabla 2), e incubar ambas reacciones a 16 oC durante 12-16 h.
- Recupere los dos conjuntos de ARN autoligados usando el mismo kit que en el paso 4.2.
NOTA: Cabe señalar que sólo una fracción del ARN mitocondrial será auto-ligada, y el ARN recuperado será una mezcla de transcripciones lineales y circularizadas. - Repita los pasos 3.3 a 3.5.
6. Transcripción inversa
- Sintetizar dos conjuntos de CDNA de las mismas cantidades de ARN circularizados de 5' tratados con polifosfatasa y no tratados (200 ng).
- Prepare una mezcla de imprimación añadiendo una proporción igual de 26S-CRT y hasta 7 otras imprimaciones RT.
NOTA: La concentración final de la mezcla de imprimación debe ser de 1 M. - Preparar dos premezclas combinando los reactivos enumerados en la Tabla3, incubar a 65oC durante 5 min y luego enfriar en hielo durante 2 min.
- Montar dos sistemas de reacción RT (Tabla4) e incubarlos a 42 oC durante 50 min.
- Calentar ambas reacciones RT a 70 oC durante 5 min, y luego enfriarlas en hielo.
7. Normalización
- Preparar dos reacciones de PCR añadiendo el mismo volumen de ACNdede de plantilla derivados de ARN polifosfatasa o no tratados de 5', imprimaciones divergentes que flanquean la unión de 5'-3' de rRNA circularizado 26S (es decir, 26S-CF1 y -CR1), etc. (Tabla5).
- Ejecute las dos reacciones en un ciclor térmico (Tabla de materiales) en las condiciones descritas en la Tabla 6.
- Preparar un gel de agarosa compuesto por 1 tampón TAE, 1,0% de agarosa y 1 x tinte de tinción nuclear.
- Añadir 2 l 10x tampón de carga (0,5% de bromofenol azul, 0,5% de xileno cianol FF y 50% de glicerol) a cada uno de los dos productos de PCR, y cargarlos en el gel.
- Ejecute el gel en 1 tampón TAE a 5-6 V/cm durante 30-40 min, e iimagee utilizando el mismo sistema de documentación de gel que el paso 3.5.
- Compare la abundancia de los dos productos pcR utilizando software informático (Tablade materiales, Figura 4A), y optimice la normalización cambiando las cantidades de cDNAs de plantilla si es necesario.
8. Amplificación de PCR
- Preparar pares de reacciones de PCR añadiendo el volumen adecuado de los CDNA normalizados y un par de imprimaciones divergentes que flanquean la unión 5'-3' de las transcripciones de destino (Tabla 7).
NOTA: La cantidad de cDNA de plantilla utilizados para la amplificación de PCR de las transcripciones de destino viene determinada por los resultados de normalización de rRNA 26S. - Realice las reacciones de PCR según el programa descrito en la Tabla 8.
- Repita los pasos 7.3 a 7.5.
- Cambie a imprimaciones divergentes anidadas y verifique los resultados de la primera ronda de PCR repitiendo los pasos 8.1 y 8.2.
- Repita los pasos 7.3 a 7.5.
- Recuperar las bandas prominentes que podrían repetirse en dos rondas de amplificación de PCR utilizando un kit de recuperación de ADN de gel (Tablade materiales).
9. Determinación de Transcripción Termini
- Clonar los productos PCR purificados por gel en un vector de extremo contundente (Tablade materiales)utilizando técnicas estándar.
- Realice la PCR de colonia para seleccionar clones positivos que contengan las inserciones de destino y secuenciarlos comercialmente.
NOTA: Los clones positivos que contienen plaquitas de tamaño variable se detectan generalmente a partir de una sola banda recuperada porque muchas transcripciones de estado estacionario en las mitocondriales vegetales tienen extremos heterogéneos de 5' y/o 3'1,12. - Alinee los datos de secuenciación con el genoma mitocondrial del maíz utilizando la herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST) del centro nacional de información biotecnológica (NCBI). Elija el organismo "maíz (taxid:4577)" y la base de datos de búsqueda "Colección de nucleótidos (nr/nt)".
- Encuentre la unión de 5'-3' de la transcripción circular, y determine las posiciones de 5' y 3' transcripción terminit.
- Calcular el tamaño de las transcripciones de destino.
10. Verificación de los resultados de mapeo cRT-PCR por ARN Gel Blot Hybridization
NOTA: La hibridación de la mancha de gel de ARN se realiza mediante un kit comercial (Tablade materiales),que contiene los reactivos para el etiquetado de transcripción de ARN con digoxigenina (DIG) y ARN T7 polimerasa, hibridación y detección inmunológica. Consulte los protocolos proporcionados en este kit para obtener más detalles. Asegúrese de que solo se utilice equipo libre de RNase para todo el procedimiento.
- Amplificar el fragmento de ADN utilizado para preparar la sonda de ARN, y clonarlo en el mismo vector que en el paso 9.1, que contiene un promotor T7 17 bp aguas arriba del sitio de inserción.
- Linealizar la construcción utilizando la enzima de restricción adecuada, recuperar el plásmido linealizado por un kit de purificación de ADN (Tablade materiales),y disolverlo en DEionizado con tratamiento DEPC H2O.
- Etiquete las sondas de ARN con DIG-11-UTP mediante un kit comercial (Tablade Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Preparar 500 ml de búfer MOPS 10x (0,2 M MOPS, 50 mM de acetato de sodio y EDTA de 10 mM) utilizando El sistema desionizado CON tratamiento DEPC H2O. Ajustar a pH 7.0 por NaOH, y esterilizar por filtración.
- Agregue de 2 a 3 volúmenes de tampón de carga (50% formamida, 6,2% de formaldehído, 1x MOPS, 10% glicerol y 0,1% de azul bromofenol) al ARN mitocondrial preparado en los pasos 3.1–3.3.
- Desnaturalice la muestra de ARN/mezcla de tampón de carga a 65 oC durante 10 minutos, y luego enfríe en hielo durante 1 min.
- Preparar un gel de agarosa desnaturalizado (2% formaldehído, 1,2% de agarosa y 1x MOPS), y cargar la mezcla de la muestra de ARN/tampón de carga en el gel (1–2 g de ARN mitocondrial por pocido).
- Ejecuta el gel en 1mopaTO a 3-4 V/cm durante 4 h.
- Preparar 2 L de 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sodio, pH 7,0). Tratarlo con 0.1% DEPC durante la noche, y esterilizar por autoclave.
- Enjuague el gel dos veces en 20x SSC (15 min cada vez), y transfiera el ARN del gel a una membrana de nylon (Tablade Materiales)por transferencia capilar con 20x SSC durante 10-16 h.
- Fijar el ARN a la membrana horneando a 120 oC durante 30 min.
- Realizar hibridación de ARN y detección inmunológica con un kit comercial (Tablade Materiales)según las instrucciones del fabricante.
11. Discriminación de los extremos primarios y procesados de 5'
- Discrimine los extremos primarios y procesados de 5' comparando los productos cRT-PCR obtenidos de los ARN normalizados tratados con polifosfatasa y no tratados.
NOTA: Para las transcripciones primarias, la abundancia de productos de PCR a partir de ARN tratado con polifosfatasa de 5' es mucho mayor que la de la contraparte no tratada (Figura1, 'Gene A' y Figura 4A). Sin embargo, a las transcripciones procesadas, un nivel comparable de productos de ITP seamplificaría a partir de los dos conjuntos de ARN mitocondriales (Figura 1, «Gene B»). - Diseñe imprimadores RT-qPCR basados en los resultados de la asignación cRT-PCR.
- Verifique los resultados de la discriminación cRT-PCR por RT-qPCR.
NOTA: Las dos muestras de ADNc derivadas de ARN tratados con polifosfatasa y no tratadas de 5' son normalizadas por los productos RT-qPCR de rRNA maduro 26S.
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Resultados
Estimación de la eficiencia de la circularización del ARN mitocondrial
En un estudio anterior, se utilizaron ARN totales y mitocondriales para la cartografía cRT-PCR de transcripción mitocondrial termini en Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), y los dos tipos de ARN dieron resultados cartográficos similares12. Inicialmente, también usamos ARN totales para el mapeo cRT-PCR...
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Discusión
En un estudio anterior, los ARN totales y mitocondriales del cultivo de suspensión celular de Arabidopsis se utilizaron para mapear la transcripción mitocondrial termini por cRT-PCR, y se obtuvieron resultados similares12. Sin embargo, sólo el ARN mitocondrial enriquecido se utilizó para mapear la transcripción mitocondrial termini en muchos otros estudios1,2,3,9
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (concesión no 31600250, Y.Z.), Proyectos de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Guangzhou (concesión no 201804020015, H.N.) y el Sistema de Investigación Agrícola de China (concesión no. CARS-04-PS09, H.N.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido acético | Aladdin, China | A112880 | Para preparar 1x tampón TAE |
| Termociclador Applied Biosystems 2720 | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | 4359659 Termociclador para amplificación de PCR | |
| Ácido ascórbico | Sigma-aldrich, EE. UU. | V900134 | Para la preparación de tampón de extracción |
| Biowest Agarosa | Biowest, España | 9012-36-6 | Para resolver PCR productos y ARNs |
| Albúmina sérica bovina | Sigma-aldrich, EE. UU | A1933 | Para la preparación de tampón de extracción |
| Azul de bromofenol | Sigma-aldrich, EE. UU | B8026 | Para la preparación de tampón de carga para electroforesis en gel de agarosa y Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, EE. UU | V900882 | Desactivación de RNasa |
| DIG Kit de inicio del norte | Roche, EE. UU | .12039672910 | Para el marcaje de DIG-RNA y Northern blot. Este kit contiene los reactivos para la transcripción-marcaje de ARN con DIG y ARN polimerasa T7, hibridación y detección quimioluminiscente. |
| EDTA | Sigma-aldrich, EE. UU | V900106 | Para la preparación de tampón de extracción y 1x tampón TAE |
| EGTA | Sigma-aldrich, EE. UU | E3889 | Para la preparación del tampón de lavado |
| Sistema de documentación de gel | Bio-Rad, EE. UU | Gel Doc XR+ | Para obtener imágenes del gel de agarosa Glicerol |
| Sigma-aldrich, EE. UU | G5516 | Para la preparación del tampón de carga para la electroforesis en gel de agarosa | |
| GoldView II (5,000x) | Solarbio,. China | G8142 | Tinción de ADN |
| Hybond-N +, membrana de nailon | Amersham Biosciences, EE. UU | RPN119 | Para Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, EE. UU | Image Lab 3.0 | Gel de imagen, y compare la abundancia de productos de PCR. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, EE. UU | V900041 | Para la preparación del tampón de extracción |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | Para la preparación del tampón de extracción |
| L-cisteína | Sigma-aldrich, EE. UU. | V900399 | Para la preparación del tampón de extracción |
| Millex | Millipore, EE. UU | SLHP033RB | Para la extracción estéril y tampones de lavado por filtración |
| Miracloth | Calbiochem, EE. UU | 475855-1R | Para filtrar los tejidos del grano molido |
| MOPS | Sigma-aldrich, EE. UU | V900306 | Para la preparación de tampón de funcionamiento para Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | 2000C | Para el ensayo de concentración y pureza de ARN |
| NaOH | Sigma-aldrich, EE. UU | V900797 | para preparación del tampón de lavado |
| pEASY-Blunt vector de clonación simple | TransGen Biotech, China | CB111 | Clonación de la banda recuperada con gel. Contiene un promotor T7 varios bps aguas arriba del sitio de inserción. |
| ADN polimerasa de superfidelidad Phanta max | Vazyme, China | P505 | ADN polimerasa para amplificación por PCR |
| Polivinilpirrolidona 40 | Sigma-aldrich, EE. UU. | V900008 | Para la preparación de tampón de extracción |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, EE. UU | Primer Premier 6.24 | Para diseñar cebadores para la transcripción inversa y la amplificación por PCR |
| Transcriptasa inversa PrimeScript II | Takara, Japón | 2690 | Para sintetizar la primera hebra de ADNc |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | 12183025 | Para la purificación de ARN |
| ARN 5' polifosfatasa | Epicentre, EE. UU. | RP8092H | Para convertir el trifosfato 5' en un |
| inhibidor de la ARNasa | monofosfato New England Biolabs, Reino Unido | M0314 | Componente de la autoligadura del ARN y de las reacciones de tratamiento con la polifosfatasa 5', y se utiliza para inhibir la actividad de la ARNasa. |
| Acetato de sodio | Sigma-aldrich, EE. UU. | V900212 | Para la preparación de tampón de funcionamiento para Northern blot |
| Cloruro de sodio | Sigma-aldrich, EE. UU | V900058 | Para preparar 20x SSC |
| SsoFas supermezclas evaGreen Bio-Rad | , EE. UU | 1725202 | para RT-qPCR |
| T4 ARN ligasa 1 | Nueva Inglaterra Biolabs, Reino Unido | M0437 | Para la circularización de ARN |
| Tetrasódico pirofosfato | Sigma-aldrich, EE. UU. | 221368 | Para la preparación del kit de |
| purificación TIANgel midi | Tiangen Biotech, China | DP209 | Para purificar fragmentos de ADN de gel de agarosa |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | Para preparar 1x tampón TAE |
| Reactivo TRIzol | Invitrogen, EE. UU | . 15596026 Para extraer ARN mitocondiral. | |
| Kit universal de purificación de ADN | Tiangen Biotech, China | DP214 | Para recuperar plastmidas linealizadas de la reacción de digestión de la enzima de restricción |
| Xileno cianol FF | Sigma-aldrich, EE. UU | X4126 | Para la preparación de tampón de carga para la electroforesis en gel de agarosa |
Referencias
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