Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.

Resumen

Las células endoteliales se han establecido para generar tensiones y tracción intercelulares, pero actualmente se desconoce el papel que desempeñan las uniones de brecha en la generación de tensión y tracción intercelular endotelial. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo basado en la mecánica para sondear la influencia de la unión de brecha connexina 43 (Cx43) tiene en la biomecánica endotelial mediante la exposición de monocapas endoteliales confluentes a un conocido inhibidor Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) y medir el impacto que este inhibidor tiene en las tracciones y tensiones intercelulares. Presentamos resultados representativos, que muestran una disminución en las tracciones y tensiones intercelulares bajo una dosis alta de chalcone (2 g/ml) en comparación con el control. Este protocolo se puede aplicar no sólo a Cx43, sino también a otros cruces de separación, suponiendo que se utilice el inhibidor adecuado. Creemos que este protocolo será útil en los campos de la investigación cardiovascular y mecanobiología.

Introducción

El campo que se refiere al estudio de los efectos de las fuerzas físicas y de las propiedades mecánicas en la fisiología celular y tisular y la patología se conoce como mecanobiología¹. Algunas técnicas útiles que se han utilizado en la mecanobiología son la microscopía de tensión monocapa y la microscopía de fuerza de tracción. La microscopía de fuerza de tracción permite el cálculo de las tracciones generadas en la interfaz célula-sustrato, mientras que la microscopía de tensión monocapa permite el cálculo de tensiones intercelulares generadas entre células adyacentes dentro de una monocapa^{2 ,}

Protocolo

1. Fabricación de geles de poliacrilamida (PA)

1. Preparación de plato de Petri
   1. Preparar la solución de silano de unión mezclando 200 ml de agua ultrapura con ácido acético de 80 ml y 50 s de metacrilato de propilo de 3(trimetoxisilo). Bind silane es una solución utilizada para funcionalizar la superficie de la placa Petri inferior de vidrio para la fijación de hidrogel.
   2. Agitar la solución de silano de unión en una placa de agitación durante al menos 1 h.
   3. Tratar el pozo central de la placa Petri con solución de silano de unión durante 45 min.
   4. Retire la solución de silano de unión y enjuague la placa P....

Resultados

Las imágenes de contraste de fase de control, 0,2 g/ml y 2 monocapas tratadas con chalcono de g/ml se tomaron 30 minutos antes del tratamiento con chalcone(Figura 1A-C)y 2 horas después del tratamiento con chalcone(Figura 1D-F). Se observó que los desplazamientos de perlas inducidos por células (m) disminuyeron tanto en condiciones de chalcona de dosis baja como de alta dosis de chalcona

Discusión

Nuestro grupo, así como otros, ha estado utilizando con éxito TFM y MSM para sondear la influenciade las uniones celulares en diversos procesos celulares patológicos y fisiológicos in vitro^7,15,18,27 . Por ejemplo, Hardin et al. presentaron un estudio muy perspicaz que sugiere que la transmisión de tensión intercelular guía la formación de brechas paracelulares en las células endoteliales

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos de 18 mm	ThermoFisher	18CIR-1	Esencial para aplanar geles de poliacrilamida
2% bis-acrilamida	BIO-RAD	1610143	Componente de gel de poliacrilamida
2′,5′-Dihidroxichalcona	SIGMA	IDF00046	Para alterar la estructura Cx43
Metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo	SIGMA	2530-85-0	Solución madre para hacer una mezcla de silano aglutinante con ácido acético y agua ultrapura
40% Acrilamida	BIO-RAD		1610140 Componente del gel de poliacrilamida
Ácido acético	Fisher-Sceintific	64-19-7	Esencial para hacer solución salina aglutinante
Alexa Fluro 488 cabra anti-ratón IgG;	ThermoFisher	Catálogo # A-11001	Anticuerpo secundario
Persulfato de amonio	BIO-RAD	1610700	Agente polimerizante en gel de poliacrilamida
Albúmina sérica bovina (BSA)	SIGMA	9048-46-8	Para hacer solución bloqueante
Solución de atelocolágeno bovino tipo I, 3 mg/mL, 100 mL	Advance Biomatrix	5005-100ML	Uso como matriz
extracelularSolución salina tamponada con fosfato para cultivo celular de Corning (1x)	Fisher-Sceintific	21040CV	Solución salina tampón necesaria para el cultivo celular
Dimetilsulfóxido, Fisher BioReactivos	Fisher-Sceintific	67-68-5	Para disolver el chalcona y hacer una solución madre
Fluoromount-G con DAPI	ThermoFisher	00-4959-52 Medio de	montaje para inmunostaing utilizado para teñir para DAPI
Microesfera fluroscente Perlas modificadas con carboxilato	ThermoFisher	F8812	Perlas modificadas con carboxilato de 0,5 micras (rojo), 2% de sólidos
Solución tampón HEPES 1 M	SIGMA	7365-45-9	Esencial para
LVES	ThermoFisher	A1460801	Esencial Suplemento HUEVC media 200
Medio 200	ThermoFisher	M200500	Medios esenciales para el cultivo
celular HUVECAnticuerpo monoclonal Cx43 de ratón (CX - 1B1)	ThermoFisher	Catálogo #13-8300	Anticuerpo primario para placa de Petri Cx43
(35 mm de diámetro)	CellVis	D35-20-1.5H Placa de	Petri de 35 mm con un pocillo central de 20 mm
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg	Proteochem	102568-43-4	Esencial para funcionalizar la superficie de gel de poliacrilamida
SYLGARD 184 Kit de elastómero de silicona	DOW corning	2646340	Elastómero de silicio con agente de curado para hacer PDMS
TEMED	BIO-RAD		Agente polimerizante en gel de poliacrilamida
Triton-X 100	SIGMA	9002-93-1	Para permeabilizar las células Tripsina
-EDTA	ThermoFisher	25300054	Se utiliza para separar células

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