Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es un problema de salud mundial. Con más de 350 millones de personas afectadas en todo el mundo, la infección por el VHB sigue siendo la principal causa de cáncer de hígado. Esta es una preocupación importante, especialmente en los países en desarrollo. La falta de montaje del sistema inmunitario contra el VHB conduce a una infección crónica. Aunque la vacuna contra el VHB está presente y se están creando nuevos medicamentos antivirales, la erradicación de las células de los reservorios de virus sigue siendo un tema de salud importante. Aquí se describe un método para la generación de antígeno viral (Ag) -cd8 específico+ linfocitos T citotóxicos (CTL) derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (es decir, iPSC-CTL), que tienen la capacidad de suprimir la replicación del VHB. La replicación del VHB se induce eficientemente en ratones a través de la inyección hidrodinámica de un plásmido de expresión de VHB, pAAV/HBV1.2, en el hígado. A continuación, los iPSC-CTL de ratón específicos de La superficie del VHB se transfieren de forma adoptiva, lo que suprime en gran medida la replicación del VHB en el hígado y la sangre, así como previene la expresión Ag de la superficie del VHB en los hepatocitos. Este método demuestra la replicación del VHB en ratones después de la inyección hidrodinámica y que los CTL virales específicos de Ag derivados de células madre pueden suprimir la replicación del VHB. Este protocolo proporciona un método útil para la inmunoterapia con VHB.
Introducción
Después de una infección aguda, el sistema inmunitario adaptativo (es decir, inmunidad humoral y celular) controla la mayor parte de la hepatitis aguda relacionada con el VHB. Sin embargo, varias personas en las regiones endémicas del VHB no pueden eliminar los virus y posteriormente convertirse como individuos crónicos. Más del 25% de los pacientes crónicos (>250 millones de personas) en todo el mundo desarrollan enfermedad hepática progresiva, lo que resulta en cirrosis hepática y/o carcinoma hepatocelular (HCC)1. Como resultado, la erradicación de las células infectadas insistentemente sigue siendo un problema general de salud, a pesar de qu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los experimentos con animales son aprobados por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Texas A&M (IACUC; #2018-0006) y se llevan a cabo de conformidad con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. Los ratones se utilizan durante 6-9 semanas de edad.
1. Generación de células virales CP8+ T específicas de ag a partir de iPSC (células iPSC-CD8+ T)
- Creación de las construcciones retrovirales
NOTA: Los genes TCR y TCR están vinculados con la secuencia de autocorte 2A. El vector retroviral MSCV-IRES-DsRed (MiDR) es DsRed+
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Como se muestra aquí, las células virales de HBV Ag-específicas iPSC-CD8+ T son generadas por un sistema de cultivo in vitro. Después de ACT de estas células virales iPSC-CD8+ T específicas de Ag suprimen sustancialmente la replicación del VHB en un modelo murino (Archivo Suplementario 1). Los iPSC de ratón se transdulan con la construcción retroviral MIDR que codifica un gen TCR híbrido de VHH humano-ratón (HBs183-191-específico, s183), luego los iPSC transducidos por ge.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo presenta un método para generar los iPSC-CTL virales específicos de Ag para su uso como ACT para suprimir la replicación del VHB en un modelo murino. En la infección crónica por el VHB, el genoma viral forma un minicromo estable, el ADN circular covalentemente cerrado (CCCDNA) que puede persistir a lo largo de la vida útil del hepatocito. Dirigirse al aclaramiento del mini cromosoma viral puede dar lugar a una cura de la infección crónica por el VHB. La terapia antiviral actual se dirige al virus a la tran.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Adam J Gehring del Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto por proporcionar ADNc para HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)- genes TCR híbridos humano-murinos específicos restringidos en A2, y el Dr. Pei-Jer Chen de la Universidad Nacional de Taiwán para proporcionar construcción pAAV/HBV 1.2. Este trabajo es apoyado por el Instituto Nacional de Salud Grant R01AI121180, R01CA221867 y R21AI109239 a J. S.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones HHD | Institut Pasteur, París, Francia | H-2 clase I knockout, ratones HLA-A2.1-transgénicos (HHD) | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 Banco de | células RIKEN | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 ATCC | CRL-2749 | ||
| pAAV/HBV1.2 plásmido | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Hospital Universitario Nacional de Taiwán, Taiwán) | Construcción de ADN | |
| del VHB Genes TCR específicos de HBs183-91(s183) (FLLTRILTI) | Dr. Adam J Gehring (Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto, Toronto, Canadá) | Genes TCR híbridos humano-murinos restringidos A2 específicos de FLLTRILTI (Vα 34 y Vβ 28) | |
| OVA257 y ndash; 264 genes TCR específicos Dr | . Dario A. Vignali (Universidad de Pittsburgh, PA) | Genes TCR restringidos por H-2Kb específicos de SIINFEKL | |
| Anticuerpo anti-CD3 (17A2) | Biolegend | 100236 | |
| Anticuerpo anti-CD44 (IM7) | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anticuerpo anti-CD4 (GK1.5) | Biolegend | 100408 | |
| Anticuerpo anti-CD8 (53-6.7) | Biolegend | ||
| Anti-IFN-y gamma; (XMG1.2) anticuerpo | Biolegend | 505810 | |
| Anticuerpo anti-TNF-a (MP6-XT22) | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anticuerpo anti-HBs | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Tampón de lisis | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion clasificador de células | BD | 656700 | |
| Gelatina | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentámero | Proimmune | F027-4A - 27 | |
| HRP Anticuerpo Secundario Anti-Ratón | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nucleasa S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehído | MilliporeSigma | P6148-500G | Precaución: Alergénico, cancerígeno, tóxico |
| Tampón de permeabilización | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Montaje antidecoloración de oro con DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
Referencias
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Células T derivadas de células madrelinfocitos T específicos para antígenos viralessupresión de la replicación del HBVcélulas T CD8 positivas derivadas de iPSCentrega hidrodinámica de plásmidos de HBVanálisis por citometría de flujomarcaje inmunofluorescentetransferencia adoptiva de célulastransducción del receptor de células Tproducción de interferón gamma
