Artículo de método

Mejora de ARN pequeño-seq: Menos sesgo y mejor detección de 2'-O-Metil RNAs

DOI:

10.3791/60056

⸱

16 de septiembre de 2019

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1Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR9198, CNRS CEA Univ Paris-Sud, Université Paris-Saclay

En este artículo

Resumen

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Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.

Resumen

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El estudio de los ARN pequeños (ARN) mediante la secuenciación de próxima generación (NGS) se ve cuestionado por problemas de sesgo durante la preparación de la biblioteca. Varios tipos de ARNS, como los microARN vegetales (miRNAs) llevan una modificación de 2'-O-metil (2'-OMe) en su nucleótido terminal de 3'. Esta modificación añade otra dificultad, ya que inhibe la ligadura del adaptador de 3'. Anteriormente demostramos que las versiones modificadas del protocolo 'TruSeq (TS)' tienen menos sesgo y una mejor detección de ARN 2'-OMe. Aquí describimos en detalle el protocolo 'TS5', que mostró el mejor rendimiento general. TS5 se puede seguir utilizando reactivos caseros o reactivos del kit TS, con el mismo rendimiento.

Introducción

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Pequeños ARN (ARN) participan en el control de una diversidad de procesos biológicos1. Los ARNm reguladores eucariotas suelen tener entre 20 y 30 nt de tamaño; los tres tipos principales son los microARN (miRNA), los ARN que interactúan con piwi (piRNA) y los ARN pequeños que interfieren (siRNA). Los niveles de expresión de miRNA aberrante se han implicado en una variedad de enfermedades2. Esto subraya la importancia de los miRNA en la salud y las enfermedades y el requisito de herramientas de investigación precisas y cuantitativas para detectar los ARNNa en general.

La secuenciación de próxim....

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Protocolo

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1. Aislamiento de pequeños ARN

  1. Extraiga el ARN total utilizando reactivos a base de fenol o cualquier otro método. Verifique si el ARN es de buena calidad.
  2. Pre-ejecutar un gel tBE-urea 15% (ver Tabla de Materiales)durante 15 min a 200 V.
  3. Mientras el gel está pre-funcionando, mezcle 5-20 g de ARN total en un volumen de 5-15 l con un volumen igual de tinte de carga de formamida (ver Tabla de Materiales;Formamida 95% desionizada, 0.025% de azul bromofenol, 0.025% de cianoleo de xileno, 5 mM EDTA pH 8) en un tubo de PCR de 200 Ol. Del mismo modo, mezcle 10 l (200 ng) de escalera de ARN pequeño (ver Ta....

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Resultados

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Los pasos críticos son el aislamiento de la pequeña fracción de ARN del material de ARN total inicial(Figura 3) y el producto de biblioteca final deseado (Figura 4). Ambos pasos implican la purificación del gel de poliacrilamida; ARN pequeño se aísla del 15% de geles de urea TBE, mientras que las bibliotecas finales están aisladas de geles TBE nativos al 6%. ARN pequeño aislado de gel se puede analizar en un pequeño chip de electroforesis capilar de ARN(.......

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Discusión

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La preparación de la biblioteca de ARN pequeño sigue siendo difícil debido al sesgo, introducido principalmente durante los pasos de ligadura del adaptador. Los ARN con una modificación de 2'-OMe en sus 3' extremos como miRNAs vegetales, piRNA en insectos, nematodos y mamíferos, y pequeños ARN que interfieren (siRNA) en insectos y plantas son particularmente difíciles de estudiar porque la modificación 2'-OMe inhibe la ligadura adaptadora de 3'. En la literatura se han propuesto una serie de soluciones para mejorar los p.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNRS), la Comisión Francesa de Energías Alternativas y Energía Atómica (CEA) y la Universidad de París-Sud. Toda la preparación de la biblioteca, la secuenciación de Illumina y los análisis bioinformáticos para este estudio se realizaron en las instalaciones de secuenciación de próxima generación (NGS) de I2BC. Los miembros de las instalaciones de I2BC NGS son reconocidos por la lectura crítica del manuscrito y sugerencias útiles.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2100 Instrumento bioanalizador  AgilentG2939BA
Ácido-fenol:Cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)ThermoFisherAM9720
Adenosina 5'-Trifosfato (ATP)Nex England BiolabsP0756S
Agencourt AMPure XP perlasBeckman CoulterA63880
Bioanalyzer Kit de ADN de alta sensibilidadAgilent5067-4626
Bioanalizador Kit de ARN pequeñoAgilent5067-1548
Filtros de tubo de centrífuga Corning Costar Spin-XSigma AldrichCLS8162-96EA
Transiluminador Dark Readervarios proveedores Kit de
PCR HotStart, con dNTPsKapa BiosystemsKK2501
NEXTflex kit pequeño RNA-seq V3BIOO ScientificNOVA-5132-05
Geles opcionales Novex TBE 6%ThermoFisherEC6265BOX
Novex TBE Geles de urea 15%ThermoFisherEC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal KitQiagen 28304
Kit de inicio de cuantificación Qubit 4ThermoFisherQ33227
Qubit ssDNA KitThermoFisherQ10212
Colorante de carga de gel de ARN (2X)ThermoFisherR0641
Colorante de carga de gel de ARN (2X)ThermoFisherR0641
Inhibidor de ARNasa, murino Nex England BiolabsM0314S
SuperScript IV Transcriptasa inversaThermoFisher18090200
SYBR Gold Tinción de gel de ácido nucleicoThermoFisherS11494
T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa)Nex England BiolabsM0204S
T4 ARN ligasa 2, truncadoNex England BiolabsM0242S
TrackIt 50 pb ADN escaleraThermoFisher10488043
TruSeq Kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeñasIlluminaRS-200-0012/24/36/48opcional
Glucógeno ultrapuroThermoFisher10814010
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
XCell SureLock Mini-CellThermoFisherEI0001
ZR escalera de ARN pequeñaZymo ResearchR1090
los dos últimos números corresponden al conjunto de índices

Referencias

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  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8

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