Artículo de método

Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo

DOI:

10.3791/60057

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30 de julio de 2019

 ,  , 
1Ruth L. and David S. Gottesman Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Research, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Cell Biology and Stem Cell Institute, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 4Albert Einstein Cancer Center and Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine

En este artículo

Resumen

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Las bombas de eflujo xenobiótico son muy activas en células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSCCP) y causan extrusión de TMRM, un tinte fluorescente potencial de membrana mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para medir con precisión el potencial de la membrana mitocondrial en los HSCCP por TMRM en presencia de Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo.

Resumen

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Como el metabolismo celular es un regulador clave de la auto-renovación de células madre hematopoyéticas (HSC), los diversos papeles desempeñados por las mitocondrias en la homeostasis hematopoyética han sido ampliamente estudiados por los investigadores de HSC. Los niveles de actividad mitocondrial se reflejan en sus potenciales de membrana ( , que se pueden medir mediante colores catiónicos persignificados por células como TMRM (tetrametilrhodamina, éster metílico). Sin embargo, la capacidad de las bombas de eflujo para extruir estos tendededores de las células puede limitar su utilidad. El sesgo de medición resultante es particularmente crítico al evaluar los HSC, ya que los transportadores xenobióticos presentan niveles más altos de expresión y actividad en los HSC que en las células diferenciadas. Aquí, describimos un protocolo que utiliza Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo, para medir con precisión a través de múltiples poblaciones de médula ósea. Se ha demostrado que la inhibición resultante de la actividad de la bomba aumenta la intensidad de la TMRM en las células hematopoyéticas del tallo y del progenitor (HSPC), mientras que la deja relativamente sin cambios en fracciones maduras. Esto pone de relieve la atención cercana a la actividad de colorante-eflujo que se requiere cuando se utilizan tintes dependientes de la m, y según lo escrito y visualizado, este protocolo se puede utilizar para comparar con precisión diferentes poblaciones dentro de la médula ósea, o la misma población en diferentes modelos experimentales.

Introducción

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Las células madre hematopoyéticas (HSC) son auto-renovadas, multipotentes, y capaces de dar lugar a todas las células de la sangre1,2. El metabolismo celular es un regulador clave del mantenimiento de HSC, juntocon factores transcripcionales, señales intrínsecas y el microambiente 3,4,5. Por lo tanto, el control adecuado de la función y la calidad mitocondriales es fundamental para el mantenimiento de HSC6,7.

El potencial de la membrana mitocondrial es un parámetro clave en la evaluación de las mitocondrias, ya que refleja directamente su funcionalidad, que deriva del equilibrio de la actividad de bombeo de protones en la cadena de transporte de electrones y el flujo de protones a través de F 1/FO ATP sintasa. Ambos son necesarios (dependiendo de la expresión génica y la disponibilidad del sustrato) para la fosforilación dependiente del oxígeno de ADP a ATP8,9. Aprovechando la electronegatividad del compartimiento mitocondrial, se han desarrollado varios colorantes potenciométricos para medir el sistema. Uno de ellos es el perclorato de éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), que se ha utilizado ampliamente para medir la citometría de flujo en una variedad de células10,incluyendo el tallo hematopoyético y las células progenitoras11.

Los tintes mitocondriales deben utilizarse con cierta precaución en los HSC, sin embargo, porque la alta actividad de las bombas de eflujo xenobiótico de estas células puede dar lugar a la extrusión de tinte12. De hecho, la extrusión de tintes mitocondriales como Rhodamine 123 ha permitido a los investigadores aislar los HSC13 o identificar las "poblaciones laterales" de HSC explotando la extrusión diferencial de los tintes Hoechst Blue y Hoechst Red14, 15. También se ha demostrado que Fumitremorgin C, un bloqueador específico del transportador de la subfamilia G de casete de unión ATP G (ABCG2), no afecta al patrón de tinción de MitoTracker en HSPCs16. Después de la publicación de estos resultados, se realizaron múltiples estudios utilizando desies mitocondriales en ausencia de inhibidores de la bomba de eflujo xenobiótico, lo que llevó a la impresión generalizada de que los HSC tienen sólo un pequeño número de mitocondrias conbajo , 17 , 18.

Recientemente, se demostró, sin embargo, que Verapamil, un inhibidor de amplio espectro de bombas de eflujo, modifica significativamente el patrón de tinción del tinte mitocondrial MitoTracker Green19. Esta discrepancia es probablemente debido al hecho de que Fumitremorgin C es altamente selectivo para Abcg2, mientras que los HSC también expresan otros transportadores como Abcb1a (que sólo es débilmente sensible a Fumitremorgin C)19. También hemos informado de que otros colorantes mitocondriales, como TMRM, Naranja acridina Nonyl y Naranja Mitotracker (MTO) exhiben los mismos patrones que Mitotracker Green. Lo que es más importante, hemos observado que los patrones citométricos de flujo de los HSCCP reflejan su m, además de la masa mitocondrial11.

La ingesta de tinte TMRM depende estrictamente de la carga negativa de las mitocondrias, pero la acumulación resultante de tinte está en equilibrio constante entre su ingesta y el aclaramiento por las bombas de eflujo20. La diferencia en la expresión de la bomba de eflujo xenobiótico entre los HSC y las poblaciones de células maduras afecta este equilibrio y puede conducir a resultados sesgados. El uso de inhibidores específicos como Verapamil debe ser considerado en el análisis de los diques potenciométricos. Aquí describimos un protocolo modificado para la medición precisa de m-m por citometría de flujo basada en TMRM que corrige la actividad del transportador xenobiótico mediante el uso de inhibidores dedicados.

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Protocolo

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Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Albert Einstein College of Medicine.

1. Preparación de soluciones

  1. Tampón de tinción (solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 2% de suero bovino fetal (FBS)): Añadir 10 ml de FBS en 500 ml de una solución estéril de PBS.
    NOTA: Esta solución se puede almacenar a 4 oC durante al menos un mes en estado estéril. Antes de iniciar los siguientes procedimientos, coloque una alícuota de esta solución (50 ml) en hielo.
  2. Tampón de lising ACK (amonio-cloruro-potasio): Coloque una alícuota de tampón de lising ACK (1 ml) sobre hielo antes de iniciar el procedimiento.
    NOTA: Para preparar el mismo tampón no comercial, disolver 8,02 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3 y 37,2 mg de Na2EDTA en 1 L de H2O. Ajuste el pH a 7.2-7.4. Conservar durante un máximo de 6 meses a temperatura ambiente.
  3. Medio de cultivo: Añadir factor de células madre de 50 ng/ml (SCF) y trombopoietina de 50 ng/ml (TPO) al medio libre de suero para el cultivo y la expansión de células hematopoyéticas (ver Tabla de Material para el medio comercial recomendado).
  4. Solución de stock TMRM: Preparar la solución TMRM (1 M) disolviendo 5 g de polvo TMRM en 10 ml de etanol. Almacene esta solución a -20 oC protegida de la luz.
  5. Solución en stock de Verapamil: Preparar la solución de Verapamil (50 mM) diluyendo 24 mg de Verapamilo en 1 ml de etanol. Almacene esta solución a -20 oC.
  6. Solución de stock FCCP: Preparar la solución de carbonilcianicida p-triflourometoxifenilhidrazona (FCCP) (1 M) disolviendo 254 mg en 1 ml de etanol. Almacene esta solución a -20 oC protegida de la luz.

2. Aislamiento de la médula ósea

  1. Euthanice el ratón por inhalación de CO2 siguiendo las pautas institucionales y rocíe a los ratones con 70% de etanol.
    NOTA: Este paso evita la contaminación de las células de interés sin comprometer los resultados experimentales.
  2. Usando un par de fórceps y tijeras afiladas, haz un pequeño recorte en la piel ventral del ratón y estira la piel.
  3. Extraiga el fémur y la tibia mientras se cuida de no desalojar las cabezas del fémur, ya que contienen una gran cantidad de células de la médula ósea. Coloque los huesos eliminados en una placa de 6 pocillos llena de 1,5 ml de tampón de tinción.
    NOTA: Este procedimiento no requiere área estéril.
  4. Retire los músculos de los huesos y corte los extremos de los huesos permitiendo la salida de la médula ósea (Figura1A). Coloque los huesos limpios en nuevos pozos con 1,5 ml de tampón de tinción.
    NOTA: Los músculos y otros tejidos deben retirarse cuidadosamente para evitar la obstrucción de la jeringa en el siguiente paso.
  5. Retire la médula ósea con una jeringa de 3 ml con una aguja de 25 G.
    NOTA: Continúe lavando la médula ósea hasta que el hueso se vuelva blanco (Figura1B).
  6. Recoger todas las células en un tubo de 1,5 ml, centrífuga durante 5 minutos a 180 x g y luego desechar el sobrenadante (Figura1C).
  7. Resuspenda el gránulo en 300 ml de tampón de lising ACK helado con mucho cuidado, ponte en hielo durante 1 min y la lisis inmediatamente inactiva añadiendo 1 ml de tampón de tinción. Centrífuga durante 5 min a 180 x g.
    NOTA: El pellet de células aparece blanco (Figura1D). El número total de células aisladas es de aproximadamente 2-4 x 107.
  8. Resuspenda los gránulos en 1 ml de tampón de tinción y filtre utilizando una tapa de colador celular (12 x 75 mm2, 5 ml de capacidad) con una malla de nylon de 35 m incorporada para obtener células mononucleares. Después de bloquear, mantenga la muestra en hielo.

3. Inmunostaining para la detección de HSC

  1. Preparar cóctel de linaje (Lin). En 400 l de tampón de tinción, añadir 4 l de los siguientes anticuerpos biotinilados contra CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM e Il7Ra para obtener una dilución final 1:100.
  2. Preparar fluoróforos conjugados-anticuerpos (Abs). En 400 l de tampón de tinción, añadir 4 l de los siguientes Abs para obtener una dilución final 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 y CD34-FITC. Mantener en hielo, protegido de la luz.
  3. Centrifugar la muestra durante 5 min a 180 x g, luego deseche el sobrenadante.
  4. Añadir 400 l de solución de cóctel Lin a las células pellet. Añadir 4 l de CD135-biotinilado Ab. Vórtice rápidamente para mezclar e incubar durante 30 minutos en hielo.
  5. Lave la muestra añadiendo 3 ml de tampón de tinción, gire hacia abajo durante 5 minutos a 180 x g y deseche el sobrenadante.
  6. Añadir 400 l de abs solución. Vórtice para mezclar e incubar rápidamente durante 30 minutos sobre hielo.
  7. Lavar las muestras con 3 ml de tampón de tinción, girar hacia abajo durante 5 minutos a 180 x g y desechar el sobrenadante.

4. Tinción TMRM

  1. Prepare la solución de tinción TMRM. Añadir 2,2 ml de solución de material TMRM y 1,1 l de Verapamil (2 nM y 50 oM como concentración final, respectivamente) en 1,1 ml de medio libre de suero para el cultivo y la expansión de células hematopoyéticas (ver Tabla de Material para el medio comercial recomendado) con TPO y SCF.
    NOTA: Este es el paso más importante del protocolo. La adición de Verapamil es necesaria para bloquear las bombas de eflujo que están muy expresadas en los HSC y pueden extruir TMRM.
  2. Resuspender la médula ósea en 1 ml de solución de tinción TMRM, vórtice rápidamente e incubar durante 1 h a 37oC.
    NOTA: La tinción TMRM no debe lavarse. El control de compensación dedicado a PE también se resuspende en 100 ml de solución de tinción TMRM y se somete a incubación durante 1 h a 37 oC después de vórtice rápido.
  3. Filtrar la muestra utilizando una tapa de colador celular (12 x 75 mm2, 5 ml de capacidad) con una malla de nylon de 35 m incorporada para evitar la obstrucción del citómetro de flujo.
    NOTA: La tinción TMRM aumenta la posibilidad de formación de obstrucciones en la muestra. Se recomienda la filtración de la muestra justo antes de los ensayos de flujo.
  4. Añadir 1 l de 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para excluir las células muertas por citometría de flujo.

5. Adquisición por catómetro de flujo

  1. Ejecuta la muestra de médula ósea y adquiere al menos 1 x 106 eventos.
  2. Configure la estrategia de gating para identificar las diferentes poblaciones hematopoyéticas (Figura2).
    1. Visualizar células mononucleares de médula ósea viva (BM-MNCs), DAPI- fracción, enparcela para Pacific Blue para identificar CD135-Lin ( Lin ) y Lin+ fracciones.
    2. Trazar Lin- fracción para APC/Cy7 (c-kit) versus PE/Cy7 (Sca-1) para identificar la fracción de progenitores multipotentes (MPP), como c-kit+ y Sca-1+.
    3. Trazar fracción MPP para APC (CD48) frente a PerCP/Cy5.5 (CD150) para identificar lafracción HSC, como CD150+ y CD48 .
    4. Visualice la fracción HSC para FITC (CD34) para dividir CD34 -HSC y CD34+-HSC.
  3. Adquirir la intensidad TMRM (canal PE) en cada población.
  4. Después de la adquisición, añadir a la muestra 1 l de FCCP para obtener la concentración final de 1 mM e incubar a 37 oC durante 5 min, luego adquirir 1 x 106 eventos.
    NOTA: FCCP es un desacoplador mitocondrial que se utiliza para disipar el ám. Se utiliza como control experimental para confirmar que la tinción TMRM funciona correctamente. Después de la administración de FCCP, la intensidad de TMRM debe disminuir drásticamente (Figura3A).
  5. Analizar los datos normalizando la intensidad media de PE de cada población por la intensidad de PE de todos los BM-MNCs.

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Resultados

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El protocolo descrito anteriormente permite el fácil aislamiento de los BMC de un modelo de ratón. La Figura 1 resume los principales pasos del protocolo: aislamiento óseo, eliminación de la médula ósea, lisis de glóbulos rojos y tinción de anticuerpos seguida de tinción TMRM para medir el potencial de la membrana mitocondrial en una población hematopoyética específica .

Los BM-MNC contienen varias poblaciones celulares, incluyendo HSCs. Los cócteles de anticuerpo...

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Discusión

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La medición del potencial de la membrana mitocondrial es una piedra angular del análisis y evaluación de las mitocondrias, que son críticas para el estado metabólico de la célula. Aquí, describimos un protocolo para el análisis de la tinción de TMRM. TMRM es un tinte fluorescente permeado por células que se acumula en las mitocondrias activas debido a los compartimentos extracelulares, citoplasmáticos y mitocondriales10. Este protocolo se puede adaptar para varios colorantes, incluyendo tetrametil...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a todos los miembros del laboratorio Ito, especialmente K Ito y H Sato, y al Instituto de Células Madre Einstein por sus comentarios y a las instalaciones básicas de Citometría e Imágenes Analíticas de Einstein Flow (financiadas por el Instituto Nacional del Cáncer P30 CA013330) ayudar a llevar a cabo los experimentos. K.I. cuenta con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01DK98263, R01DK115577 y R01DK100689) y del Departamento de Salud del Estado de Nueva York como Director Principal de Genómica/Eyómica de Células Simples de Einstein (C029154). K.I. Ito es un estudioso de investigación de la Sociedad de Leucemia y Linfoma.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tampón de lisado ACKLife TechnologiesA1049201
B220-biotinaBD Bioscience553086
CD3e-biotinaLife Technologies13-0031-85
CD4-biotinaFischer Scientific BDB553782
CD8-biotina LifeTechnologies13-0081-85
CD11b-biotinaBD Bioscience553309
CD19-biotinaBD Bioscience553784
CD34-FITCeBioscience11-0341-85
CD48-APCeBioscience17-0481-82
CD135-biotinaeBioscience13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5 Biolegend115922
c-kit-APC/Cy7Biolegend105826
Cyclosporin HMillipore SigmaSML1575-1MG
DAPI solución (1 mg/mL)Life Technologies62248
Suero fetal bovino (FBS)DenvilleFB5001-H
FCCPMillipore SigmaC2920-10MG
Gr1-biotinaBiolegend108404
IgM-biotinaLife Technologies13-5790-85
Il7Rα-biotinaeBioscience13-1271-85
Nk1.1-biotinaFischer ScientificBDB553163
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Life Technologies10010023
Sca-1-PE/Cy7eBioscience25-5981-81
SCF murinoPEPROTECH250-03-10UG
StemSpan SFEM medio STEMCELLtechnologies9605
Estreptavidina-Pacific BlueeBioscience48-4317-82
Ter119-biotinaFischer ScientificBDB553672
TMRMMillipore SigmaT5428-25MG
TPOPEPROTECH315-14-10UG
Clorhidrato de verapamiloMillipore SigmaV4629-1G

Referencias

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