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Artículo de método

Plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en la enfermedad de injerto contra huésped

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DOI:

10.3791/60083

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17 de marzo de 2020

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1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La enfermedad de injerto contra huésped es una complicación importante después del trasplante alogénico de médula ósea. Las células dendríticas desempeñan un papel crítico en la patogénesis de la enfermedad del injerto contra el huésped. El artículo actual describe una nueva plataforma de trasplante de médula ósea para investigar el papel de las células dendríticas en el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped y el efecto injerto-contra-leucemia.

Resumen

El trasplante alogénico de médula ósea (BMT) es una terapia eficaz para neoplasias malignas hematológicas debido al efecto injerto-contra leucemia (GVL) para erradicar los tumores. Sin embargo, su aplicación está limitada por el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), una complicación importante de la MtB. La EICH se evoca cuando las células T en los injertos de donantes reconocen el clorótatógeno expresado por las células receptoras y montan ataques inmunológicos no deseados contra tejidos sanos receptores. Por lo tanto, las terapias tradicionales están diseñadas para suprimir la aleeactividad de las células T del donante. Sin embargo, estos enfoques perjudican sustancialmente el efecto GVL para que no se mejore la supervivencia del receptor. Por lo tanto, es esencial comprender los efectos de los enfoques terapéuticos en bMT, GVL y EICH. Debido a las capacidades de presentación de antígenos y secretodenia para estimular las células T del donante, las células dendríticas receptoras (CC) desempeñan un papel importante en la inducción de la EICH. Por lo tanto, la segmentación de los controladores de datos de los destinatarios se convierte en un enfoque potencial para controlar la EICH. Este trabajo proporciona una descripción de una nueva plataforma BMT para investigar cómo los cAños anfitriones regulan las respuestas de GVH y GVL después del trasplante. También se presenta un modelo BMT eficaz para estudiar la biología de la EICH y la EV después del trasplante.

Introducción

El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (BMT) es una terapia eficaz para tratar las neoplasias malignas hematológicas1,2 a través del efecto injerto-contra-leucemia (GVL)3. Sin embargo, los linfocitos de donantes siempre montan ataques inmunológicos no deseados contra los tejidos receptores, un proceso llamado enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD)4.

Los modelos murinos de La EICH son una herramienta eficaz para estudiar la biología de la EICH y la respuesta GVL5. Los ratones son un modelo animal de investigación rentable. Son pequeñas y eficientemente dosificados con moléculas y productos biológicos en las primeras fases del desarrollo6. Los ratones son animales de investigación ideales para estudios de manipulación genética porque están genéticamente bien definidos, lo que es ideal para el estudio de vías y mecanismos biológicos6. Se han establecido bien varios modelos de GHC de MHC de complejos de histocompatibilidad (MHC) de ratón, como C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) y FVB (H2q) , C57BL/6 (H2b)5,7. Estos son modelos particularmente valiosos para determinar el papel de los tipos de células individuales, genes y factores que afectan a la EICH. El trasplante de C57/BL/6 (H2b) a receptores con mutaciones en MHC I (B6.C-H2bm1)y/o MHC II (B6.C-H2bm12) reveló que un desajuste tanto en MHC clase I como en clase II es un requisito importante para el desarrollo de la EICH aguda. Esto sugiere que tanto CD4+ como CD8+ T-células son necesarias para el desarrollo de la enfermedad7,8. La EICH también participa en una cascada inflamatoria conocida como la «tormenta proinflamatoria de la citoquina»9. El método de acondicionamiento más común en los modelos murinos es la irradiación corporal total (TBI) por rayos X o 137Cs. Esto conduce a la ablación de la médula ósea del receptor, permitiendo así el injerto de células madre del donante y previniendo el rechazo del injerto. Esto se hace limitando la proliferación de células T receptoras en respuesta a las células donantes. Además, las disparidades genéticas desempeñan un papel importante en la inducción de la enfermedad, que también depende del menor de coincidencia de MHC10. Por lo tanto, la dosis de irradiación mieloablativa varía en diferentes cepas de ratón (por ejemplo, BALB/c-C57BL/6).

La activación de las células T del donante por las células que presentan el antígeno host (ACC) es esencial para el desarrollo de la EICH. Entre los ACC, las células dendríticas (CC) son las más potentes. Son herediblemente capaces de inducir la EICH debido a su ingesta superior de antígenos, la expresión de moléculas coestimulantes de células T y la producción de citoquinas proinflamatorias que polarizan las células T en subconjuntos patógenos. Los CI receptores son fundamentales para facilitar el cebado de células T y la inducción de la EICH después del trasplante11,12. En consecuencia, los centros de interesado se han convertido en objetivos interesantes en el tratamiento de la EICH12.

Se requiere TBI para mejorar el injerto de células del donante. Debido al efecto TBI, los cocones receptores se activan y sobreviven durante un breve periodo de tiempo después del trasplante12. A pesar de los importantes avances en el uso de la bioluminiscencia o la fluorescencia, el establecimiento de un modelo eficaz para estudiar el papel de los DC receptores en la EICH sigue siendo un desafío.

Debido a que las células T del donante son la fuerza motriz para la actividad de GVL, las estrategias de tratamiento que utilizan medicamentos inmunosupresores como los esteroides para suprimir la aoresación de células T a menudo causan recaída tumoral o infección13. Por lo tanto, los dispositivos de compra de beneficiarios pueden proporcionar un enfoque alternativo para tratar la EICH, preservando al mismo tiempo el efecto GVL y evitando la infección.

En resumen, el estudio actual proporciona una plataforma para comprender cómo los diferentes tipos de señalización en los CC receptores regulan el desarrollo de la EICH y el efecto GVL después de BMT.

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Protocolo

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Florida Central.

1. Inducción de la EICH

NOTA: El trasplante de células alogénicos de médula ósea (BM) (paso 1.2) se realiza dentro de las 24 h después de la irradiación. Todos los procedimientos descritos a continuación se realizan en un entorno estéril. Realice el procedimiento en una campana de cultivo de tejido y utilice reactivos filtrados.

  1. Día 0: Preparar los ratones receptores.
    1. Utilice ratones de tipo salvaje femenino (WT) en un fondo BALB/c (CD45.2+ H2kd+),de 10 a 12 semanas como receptores.
    2. Etiqueta de oído y sopesar a los destinatarios antes de TBI. Luego, coloque hasta 11 ratones en la cámara de irradiación y guárdelo en el irradiador. Irradiar a una sola dosis de 700 cGy durante 10 a 15 min.
    3. Devolver los animales irradiados a las jaulas y alojarlos en instalaciones libres de patógenos antes del trasplante.
      NOTA: El peso corporal mínimo de los receptores debe ser alrededor de 20 g. Utilice este peso como referencia para calcular la pérdida de peso corporal durante el período experimental.
  2. Día 1: Preparar la médula ósea agotada de las células T (TCD-BM) de los ratones donantes.
    1. Euthanizar CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 ratones por asfixia de CO2 y esperar 2 x 3 minutos hasta que estén inconscientes. Realice la luxación cervical como una eutanasia secundaria si es necesario.
    2. Coloque cada ratón en una mesa de trabajo limpia. Desinfectar el pelaje y la piel con 70% isopropanol.
    3. Recoge la tibia y el fémur de ambas piernas usando fórceps y tijeras. Póngalos en RPMI heladaque contengan 1% FCS y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina (1% RPMI) en tubos cónicos de 50 ml. Limpie el fémur y los huesos de la tibia a fondo eliminando todos los tejidos musculares usando fórceps y tijeras. Transfiera el fémur y la tibia de los tubos cónicos de 50 ml a una placa Petri de 92 mm de diámetro que contenga 1% de RPMI.
    4. Usando tijeras, corta los extremos del fémur o la tibia. Llenar un tubo de 50 ml con 25 ml de 1% RPMI 1640 medio. Utilice esta utilidad para llenar una jeringa de 3 ml unida a una aguja de 26 G con 3 ml de 1% de RPMI. Inserte esta jeringa en el hueso y empuje el émbolo para vaciar la médula ósea (BM) fuera de la cavidad en el tubo de recolección con un 1% de RPMI (3 ml/hueso).
    5. Repita el paso 1.2.4 para todos los huesos restantes de tibia y fémur de otros ratones donantes. Mantenga todos los tubos de recogida en hielo.
    6. Haga la suspensión de una sola célula lavando las piezas de la médula ósea a través de un colador de células de malla de 75 m. Recoger la suspensión de una sola célula en un tubo de 50 ml.
    7. Tubos centrífugos a 800 x g durante 5 min a 4oC. Aspira y descarta el sobrenadante. Resuspenda el pellet en el tampón PBS que contenga 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) a 20 x 106 células/ml. Guarde una alícuota de 2 x 106 células para la tinción de pureza.
    8. Añadir el anticuerpo Thy 1 a 0,05 ég/106 células14 e incubar durante 30 min a 4oC. Lavar una vez con PBS helado de 25 ml. Resuspender a 20 x 106/mL en 0,5% BSA/10% complemento de conejo joven/2% DNase (10.000 U/ml en estéril H2O). Incubar durante 45 min a 37oC y lavar 2oC como antes.
      NOTA: Las células T se agotan utilizando un mAb específico para Thy1, una proteína expresada por todas las células T, pero no por otros leucocitos.
    9. Resuspenda las celdas en 20 ml de búfer PBS que contengan 0,5% de BSA. Cuente las células de la médula ósea en ácido acético al 1% usando un hemocitómetro. Mantenga una alícuota de 2 x 106 células para una comprobación de pureza por citometría de flujo después de la purificación celular.
      NOTA: Un ratón donante normalmente genera alrededor de 25 x 106 TCD-BM.
    10. Utilice la citometría de flujo para confirmar un agotamiento exitoso de la célula T. Manchas 1 x 106 células, conservadas de los pasos 1.2.7 (antes del agotamiento de la célula T) y 1.2.9 (TCD-BM después del agotamiento de la célula T) con los siguientes anticuerpos: -CD3 (17A2), CD4 (GK1.5) y -CD8 (53-6.7).
  3. Día 1: Preparar células T de los ratones donantes
    1. Utilice ratones CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 de tipo salvaje (WT) como donantes para las células T.
    2. Euthanizar ratones C57BL/6 por asfixia de dióxido de carbono (CO2) como se describe en 1.2.1.
    3. Limpie bien el pelaje y la piel del ratón con un 70% de etanol. Insinúe los bazos y los ganglios linfáticos y sepárelos en una suspensión de una sola célula de los esplenocitos utilizando un émbolo de jeringa y coladores de malla de 40 m. Lave el colador y el émbolo de la jeringa con un 1% de RPMI (1% de FBS que contiene medios RPMI) para recoger todos los esplenocitos.
    4. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g durante 5 min a 4oC. Añadir 5 mL de tampón de lising ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) después de desechar el sobrenadante. Incubar la suspensión celular durante 5 min a temperatura ambiente.
      NOTA: El tampón de lisis ack se utiliza para lising de glóbulos rojos.
    5. Añadir 5 ml de 1% de RPMI para detener la lisis. Centrífuga a 800 x g durante 5 min a 4oC. Descarta el sobrenadante.
    6. Preparar el búfer de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) de hielo frío (0,5% BSA, 2 mM EDTA en PBS, pH 7.2). Desgasifique el búfer antes de usarlo. Resuspenda los pellets de celda en 5 ml del búfer MACS.
    7. Cuente los esplenocitos y compruebe si hay células vivas y muertas usando un hemocitómetro y un 1% de trippan azul. Ahorre una alícuota de 2 x 106 células para evaluar el rendimiento de purificación con el análisis de citometría de flujo.
    8. Resuspenda los esplenocitos a una concentración de 200 x 106/mL en el búfer MACS. Añadir 0,03 l de biotina anti-ratón-Ter-119, 0,03 l de biotina anti-ratón-CD11b, 0,03 l de biotina anti-ratón-CD45R, y 0,03 l de biotina anti-ratón-DX5 por 106 células. Incubar durante 15 min a 4oC.
      NOTA: Biotina antiratón-Ter-119, biotina anti-ratón-CD11b, biotina anti-ratón-CD45R, y biotina anti-ratón-DX5 se utilizaron para reaccionar con eritróidos, granulocitos, células B, y células NK respectivamente. Por lo tanto, estos subconjuntos de celdas se agotan en el paso15siguiente.
    9. Agregue 10 ml de búfer MACS helado a la suspensión celular. Centrífuga a 800 x g durante 5 min a 4oC. Descarta el sobrenadante.
    10. Resuspenda los gránulos celulares en el búfer MACS a una concentración de 100 x 106/mL. Añadir microperlas antibiotinas (0,22 l/106 células) a la suspensión del esplenocito. Mezclar bien e incubar durante 15 min adicionales a 4 oC. Lave la suspensión celular una vez con 10 ml de tampón MACS helado. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4oC y desechar el sobrenadante.
    11. Ponga una columna de separación magnética en el campo magnético. Enjuague la columna con 3 ml de búfer MACS. Suelte la suspensión de la celda en la columna. Recoger el flujo a través de células T sin ataduras, enriquecidas, en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Lave la columna MS con 3 ml de búfer MACS helado.
      NOTA: Asegúrese de que la columna esté vacía antes de realizar los pasos de lavado.
    12. Centrifugar la suspensión celular a 800 x g durante 5 min a 4oC. Resuspenda el pellet de celda en 5 ml del búfer MACS.
    13. Cuente las células en 1% trypan azul usando un hemocaquímetro. Guarde una alícuota de 2 x 106 células para una comprobación de pureza por citometría de flujo.
      NOTA: El rendimiento medio de las células T esplénicas aisladas por este método es de 20 a 25 x 106 celdas por ratón.
    14. Confirmar el rendimiento del enriquecimiento de células T por citometría de flujo. Manchas 1 x 106 células, conservadas de los pasos 1.3.7 (antes del agotamiento de la célula T) y 1.3.13 (TCD-BM después del agotamiento de la célula T), con los siguientes anticuerpos: -CD3 (17A2), -CD4 (GK1.5) y -CD8 (53-6.7).
  4. Día 1: Inyecte ratones irradiados con células T de donante y TCD-BM.
    1. Lavar las células TCD-BM y T 2x con PBS (800 x g durante 5 min a 4oC). Resuspenda las células en PBS helado para inyección. Ajuste la concentración de celdas a 20 x 106/mL para TCD BM y 4 x 106/mL para las células T.
    2. Calienta al animal usando una lámpara de calentamiento para aumentar la visibilidad de las venas traseras bilaterales. Si es necesario, coloque el ratón en un restrainer.
    3. Limpie la superficie de la cola con un 70% de isopropanol. Inyectar TCD-BM (5 x 106 celdas/ratón) con o sin células T (0,75 x 106 celdas/ratón). Tenga cuidado de no introducir aire en la jeringa.
    4. Retire la aguja y aplique un hisopo antiséptico directamente en el lugar de inyección de 5 a 10 s para detener cualquier sangrado.
  5. Evaluar la EICH en los días 2 a 80.
    1. Lleve un registro de la supervivencia animal. Monitorear los signos clínicos de la EICH adaptados del sistema de puntuación establecido previamente por Cook et al.16 y el peso corporal de los ratones receptores 2 veces por semana. Utilice el peso corporal determinado antes del TBI para calcular la pérdida de peso corporal.
    2. Pesar cada ratón individualmente. Puntuar la pérdida de peso de la siguiente manera: grado 0 a menos del 10%; grado 1 - 10%-20%; grado 2 - más del 20%.
    3. Puntuar el signo de postura de los destinatarios: grado 0 - ninguna corazonada; grado 0.5 - ligera corazonada, pero se endereza al caminar; el animal de grado 1 permanece encorvado al caminar; grado 1.5 - animal no se endereza; grado 2.0 - soporte de animales en los dedos traseros.
    4. Puntuar el signo de movilidad de los destinatarios: grado 0 - muy activo; grado 0,5 o más lento que los ratones ingenuos; grado 1.0 - se mueve sólo cuando se pincha; grado 1.5 - se mueve ligeramente cuando se pincha; grado 2.0 - no se mueve cuando se pincha.
    5. Puntuar la piel de los receptores: grado 0 - sin abrasiones, lesiones, o escala; grado 0,5 - enrojecimiento en un área específica; grado 1 - abrasión en una zona o abrasión leve en dos áreas; grado 1.5 - abrasiones graves en dos o más áreas; grado 2.0 - abrasiones severas, agrietamiento de la piel, sangre seca.
    6. Puntuar el pelaje de los receptores: grado 0 - sin signos anormales; grado 0,5o de ridging en el lado del vientre o la nuca, grado 1.0 o ridging a través o el lado del vientre y el cuello; grado 1.5 - pelaje mate y rudo descuidado; grado 2.0 - piel mal mate en el vientre y la espalda.
    7. Puntuar la diarrea de los receptores: grado 0 - sin diarrea; grado 0.5 - heces ligeras y blandas; grado 1.0 - leve (heces amarillas); grado 1.5 o moderado (heces amarillas con un poco de sangre); grado 2 - severo (heces amarillas y sangrientas, "heces de tortas secas" aparecen en el área anal).

2. Modelo de cotrasplante

  1. Generar células dendríticas derivadas de la médula ósea (BM-CP).
    1. Aislar la médula ósea de los fémures y tibias de los ratones WT o factor B (fB)-/- en el fondo B6 como se describe en los pasos 1.2.3-1.2.4. Gire las células a 800 x g durante 5 min.
    2. Resuspenda el gránulo en 5 ml de tampón de lising ACK para la lisis de glóbulos rojos. Incubar la suspensión celular durante 5 min sobre hielo. Añadir 10 ml de 1% de RPMI a la suspensión celular para detener la lisis y la centrífuga a 800 x g durante 5 min a 4 oC. Descarta el sobrenadante.
    3. Resuspender los gránulos celulares en 10 ml de medios de cultivo (RPMI 1460 que contiene 10% FBS, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 2 mM de l-glutamina y 50 mM de mercaptoetanol) y ajustar el volumen para satisfacer la concentración final de 2 x 106 células/ml.
    4. Añadir 20 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofago (GM-CSF) a la suspensión celular. Cultivar las células de la médula ósea en platos Petri de 100 x 15 mm a 37 oC en 5% CO2 durante 6 días.
    5. Reemplace la mitad de los medios de cultivo en curso (alrededor de 5 ml) por medios frescos que contengan 40 ng/mL GM-CSF el día 3.
    6. Precalentar los medios de cultivo en un baño de agua a 37 oC. Recoger unos 5 ml de los medios de comunicación de los platos de cultivo de médula ósea. Centrífuga a 800 x g durante 5 min a 4oC. Descarta el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular en medios de cultivo de 5 ml que contengan 40 ng/mL GM-CSF.
    7. Añadir 25 g/ml de lipopolisacárido (LPS) a los medios el día 6 del cultivo para madurar los BMC-DC.6
    8. Recoger BM-DCs maduros: Utilice elevadores celulares para raspar suavemente los C. de los platos Petri. Recoger todas las suspensiones celulares en tubos cónicos de 50 ml. Centrífuga a 800 x g,durante 5 min a 4oC. Descarta el sobrenadante. Lavar los pellets celulares 3x con 50 ml de PBS helado. Ahorre alrededor de 2 x 106 BM-DCs para el análisis de fenotipos inmunológicos por citometría de flujo.
  2. Realizar el cotrasplante de células dendríticas de BMT (BMT-cotransplanting DC).
    NOTA: Utilice ratones FVB (H2kq) como donantes para células T y células BM. Irradiar ratones receptores de Irradiar B6 Ly5.1 a una dosis de 1.100 cGy (2 dosis, intervalo de 3 h). Vea los detalles en el paso 1.1.
    1. Aísle BM de los fémures y tibias de los ratones donantes FVB. Vea los detalles en los pasos 1.2.3-1.2.10.
      NOTA: Utilice la médula ósea aislada total en lugar de TCD-BM en este modelo.
    2. Purificar las células T de los bazos y los ganglios linfáticos de los ratones donantes FVB. Vea los detalles en los pasos 1.3.1-1.3.13.
    3. Inyectar BM (5 x 106/ratón), células T (0,5 x 106/ratón) con BMC-DCs (2 x 106/ratón) el día 0 del curso experimental.
    4. El día 3 después del trasplante, examine la reconstitución del donante DC por citometría de flujo.
      1. Recoger sangre de los ojos de los receptores.
      2. Anestetizar los ratones CD45.1/Ly5.1 B6 por un 3% de inhalación de isoflurano. Compruebe la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a un pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo.
      3. Coloque un tubo de pipeta de vidrio estéril en el canthus medial del ojo dirigido caudalmente a un ángulo de 30 a 45o desde el plano de la nariz. Aplique presión mientras gira suavemente el tubo.
      4. Suelte la sangre en tubos estériles de 1,5 ml de microcentrífuga que contienen heparina de 10 ml. Transfiera 50 l de sangre a tubos de flujo de vidrio de 5 ml.
      5. Agregue 2 mL del búfer de lising ACK. Incubar a 37oC en baño de agua durante 45 min. Añadir 2 mL de tampón de tinción FACS. Centrífuga a 800 x g durante 5 min a 4oC. Descarta el sobrenadante.
      6. Resuspenda los gránulos celulares con 200 ml de tampón de FACS que contengan anticuerpos de tinción de flujo apropiados (amarillo vivo/muerto, h-2Kb, CD45,1, CD45,2, CD11c y MHCII). Incubar durante 15 min a 4oC en la oscuridad. Lave 2x con búfer FACS de 1 ml. Resuspenda los gránulos celulares en 200 ml de tampón FACS y realice el análisis mediante citometría de flujo.

3. Modelos GVHD/GVL de BMT

  1. Realice la inducción GVHD/GVL.
    1. Cultivo del linfoma de células A20 B transducido por luciferas en medios de cultivo RPMI.
    2. Irradiar BALB/c fondo WT o Ly5.1 receptor a 700 cGy (dosis única). Vea los detalles en el paso 1.1.
    3. Aísle TCD-BM de los fémures y tibias de B6. Ly5.1 ratones donantes. Vea los detalles en los pasos 1.2.1-1.2.10.
    4. Purificar las células T de bazos y ganglios linfáticos de los ratones donantes C57BL/6. Vea los detalles en los pasos 1.3.1-1.3.15.
    5. Lavar el linfoma A20 2x con 25 ml de PBS. Resuspenda los gránulos celulares en 10 ml de PBS helado. Tome una alícuota de suspensión celular (10 l) y cuente las células usando 1% trypan azul y un hemocitómetro. Ajuste la concentración celular a 20.000 celdas/ml.
    6. Inyectar TCD-BM (5 x 106/ratón) con o sin células T (0,75 x 106/ratón) y linfoma A20 (5.000 células/ratón).
    7. Seguimiento de la supervivencia del receptor, signos clínicos de la EICH y pérdida de peso corporal durante el curso experimental. Vea los detalles en el paso 1.5.
  2. Realice imágenes bioluminiscentes.
    1. Supervise el crecimiento del tumor en el receptor trasplantado inyectando a los ratones receptores 4 mg de D-luciferina. Incubar durante 5 minutos para asegurar que la luciferina reacciona con luciferasa.
    2. Anestetizar el ratón usando 3% de isoflurano en la cámara de un imager de bioluminiscencia e imagen de los destinatarios durante 5 minutos en el campo D y el tiempo de exposición de 1 min.
    3. Analice los datos utilizando el software de análisis de imágenes. Cambie la escala de las imágenes de pseudocolor para obtener mejores resultados.
      NOTA: Todas las imágenes deben estar a la misma escala en todos los experimentos.
    4. Utilice el software de análisis de imágenes para determinar las regiones de interés y cuantificar la densidad de la señal calculando el flujo (fotones/s) que se emite desde cada región de interés.

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Resultados

El principal modelo B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd) correspondió estrechamente al desarrollo de la EICH después del trasplante(Figura 2). Los seis signos clínicos de la EICH establecidos anteriormente por Cooke et al.16 ocurrieron en los receptores trasplantados con células T WT-B6, pero no en los receptores trasplantados solo con BM (paso 1.5), que representaba el grupo negativo de la EICH. Hay dos fases en el desarrollo...

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Discusión

El uso de células madre para adaptarse a un individuo en particular es un enfoque eficaz para tratar cánceres avanzados y resistentes18. Los productos farmacéuticos de moléculas pequeñas, sin embargo, han permanecido durante mucho tiempo un foco principal de la terapia personalizada contra el cáncer. Por otro lado, en la terapia celular una multitud de interacciones entre el donante y el huésped puede influir decisivamente en los resultados del tratamiento, como el desarrollo de la EICH después de...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio es apoyado por la beca de inicio de la Universidad de Florida Central College of Medicine (a HN), la beca de inicio del Centro de Cáncer Hillman de la Universidad de Pittsburgh, Hillman Cancer Center (a HL), la Subvención NIH de los Estados Unidos #1P20CA210300-01 y la Beca del Ministerio de Salud de Vietnam #4694/QD-BYT (a PTH). Agradecemos al Dr. Xue-zhong Yu de la Universidad Médica de Carolina del Sur por proporcionar materiales para el estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA pH 8.0 100MLFisher ScientificBP2482100tampón MACS
10X PBSFisher ScientificBP3994Tampón MACS
A20 Linfoma de células BUniversidad de Florida CentralExperimento GVLinterno
ACC1 fl/flJackson Lab30954Experimento GVL
ACC1 fl/fl CD4creUniversidad de Florida CentralExperimento GVL
Anti-Biotina MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-485Enriquecimiento de células T
Anti-Humano/Ratón CD45R (B220)Thermo Fisher Scientific13-0452-85Enriquecimiento de células T
Anti-ratón B220 FITCThermo Fisher Scientific10452-85Análisis de citometría
de flujo Anti-ratón CD11c- AF700Thermo Fisher Scientific117319Análisis de citometría de flujo
Anti-Mouse CD25 PEThermo Fisher Scientific12-0251-82Tinción
de flujo Anti-Mouse CD4 BiotinaThermo Fisher Scientific13-0041-86Enriquecimiento de células T
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® de reemplazo)Thermo Fisher Scientific48-0042-82Tinción
de flujo Anti-ratón CD45.1 PEThermo Fisher Scientific12-0900-83Análisis de citometría
de flujo Anti-ratón CD8a APCThermo Fisher Scientific17-0081-83Análisis de citometría de flujo
Anti-ratón H-2Kb PerCP-Fluor 710Thermo Fisher Scientific46-5958-82Análisis de citometría de flujo
Anticuerpo MHC de clase II APCThermo Fisher Scientific17-5320-82 Análisis decitometría de flujo
Anti-Mouse TER-119 BiotinaThermo Fisher Scientific13-5921-85Enriquecimiento de células T
Anti-Thy1.2Bio ExcelBE0066BM generación
B6 fB-/- ratonesUniversidad de Florida CentralReceptoresinternos
B6. Ratones Ly5.1 (CD45.1+)Río Charles564Donantes
Ratones BALB/cCharles River028Receptores de trasplantes
C57BL/6 ratonesCharles River027Donantes/Receptores
CD11bThermo Fisher Scientific13-0112-85Enriquecimiento de células T
CD25-biotinaThermo Fisher Scientific13-0251-82Enriquecimiento de células T
CD45RThermo Fisher Scientific13-0452-82Enriquecimiento de células T
CD49b Anticuerpo monoclonal (DX5)-biotinaThermo Fisher Scientific13-5971-82Enriquecimiento de células
T Filtro de células 40 uMThermo Fisher Scientific22363547 Preparación de células
Filtro de células 70 uMThermo Fisher Scientific22363548Preparación
de célulasD-LuciferinGoldbioLUCK-1GImágenes de animales vivos
Suero fetal bovino (FBS)Atlanta Bilogicals R& Sistema DD17051Cultivo celular
Tubos de citometría de flujoFisher Scientific352008Análisis de citometría de flujo
FVB/NCrlCharles River207
Donantes Lipopolisacárido (LPS)Millipore SigmaL4391-1MGDC columna
LSMitenyi Biotec130-042-401Preparación
celular MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302Enriquecimiento de células T
Incubadora New Brunswick Galaxy 170REppendorfGalaxy 170 RCell Culture
Penicilina+estreptomicinaPenicilina/Estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg/ml estreptococo)GIBCO15140Media
RPMI 1640Thermo Fisher Scienctific11875-093Media
TER119Thermo Fisher Scientific13-5921-82Enriquecimiento de células T
Xenogen IVIS-200Perkin ElmerXenogen IVIS-200Imágenes de animales
vivos X-RAD 320 Irradiador biológicoprecisión X-RAYX-RAD 320Irradiación corporal total
madura de

Referencias

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