Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.
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Artículo de método
Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos
En este artículo
Resumen
Resumen
La proyección visual primaria de renacuajos de la rana acuática Xenopus laevis sirve como un excelente sistema modelo para el estudio de mecanismos que regulan el desarrollo de la conectividad neuronal. Durante el establecimiento de la proyección retino-tectal, los axónicos ópticos se extienden desde el ojo y navegan a través de regiones distintas del cerebro para llegar a su tejido objetivo, el tectum óptico. Una vez que los axons ópticos entran en el tectum, elaboran árboles terminales que funcionan para aumentar el número de conexiones sinápticas que pueden hacer con las interneuronas objetivo en el tectum. Aquí, describimos un método para expresar la codificación del ADN de la proteína fluorescente verde (GFP), y construcciones genéticas de ganancia y pérdida de función, en neuronas ópticas (células ganglionares retinianas) en embriones de Xenopus. Explicamos cómo microinyectar un reactivo combinado de ADN/lipofección en los eyebudsdes de un día de edad, de modo que los genes exógenos se expresan en un solo o pequeño número de neuronas ópticas. Mediante el etiquetado de genes con GFP o co-inyección con un plásmido GFP, los árboles axonales terminales de neuronas ópticas individuales con señalización molecular alterada se pueden imaginar directamente en cerebros de renacuajos de Xenopus intactos y vivos varios días más tarde, y su morfología se puede cuantificar. Este protocolo permite la determinación de mecanismos moleculares autónomos celulares que subyacen al desarrollo de la arborización de axón óptico in vivo.
Introducción
Durante el desarrollo del sistema nervioso, axons de neuronas presinápticas navegan a través de diversas regiones del cerebro para llegar a sus áreas objetivo. Cuando los axons invaden sus tejidos diana, establecen conexiones sinápticas con las neuronas diana postsinápticas. En muchos tipos de neuronas, los axons aumentan el número y la extensión espacial de las conexiones sinápticas que pueden hacer mediante la elaboración de redes de ramas terminales o arbores1. La proyección retino-tectal de renacuajos de la rana acuática Xenopus laevis es un potente modelo de vertebrado para examinar los mecanismos subyacentes a la arborización ter....
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Touro de California (Protocolo n.o TUCA003TE01X).
1. Obtención de embriones X. laevis
- Obtener embriones X. laevis mediante el apareamiento natural de pares de ranas adultas masculinas y femeninas preparadas con gonadotropina coriónica humana (HCG), mediante la fertilización in vitro de óvulos derramados de ranas hembra adultas preparadas con HCG, o ordenando directamente(Tabla de Materiales).
- Embriones Dejelly obtenidos con una solución de ciste....
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Resultados
El protocolo descrito en este artículo produce una tasa de éxito de 30-60% de embriones xenopus inyectados que expresan GFP (solo o junto con construcciones de ADN adicionales) en uno a diez árboles axonales ópticos. En la Figura 3,mostramos imágenes confocales representativas de GFP expresando el control y los árboles axonales ópticos mutantes en renacuajos Xenopus intactos de nuestro estudio publicado recientemente7. Para este estudio, clonamos dos.......
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Discusión
En este artículo, demostramos cómo expresar construcciones de ADN exógeno en un solo o pequeño número de neuronas ópticas y cómo crear imágenes individuales de GFP que expresan árboles axonales ópticos con señalización molecular normal y alterada en renacuajos vivos intactos de la rana X . laevis. También explicamos cómo reconstruir y cuantificar la morfología de GFP expresando árboles axonales ópticos a partir de imágenes capturadas in vivo. Para expresar plásmidos de ADN exógenos en un pequeño número de neuron.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Touro University California College of Osteopathic Medicine por apoyar nuestra investigación. Reconocemos a estudiantes anteriores en el laboratorio (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) que ayudaron a implementar esta técnica de microinyección en nuestro laboratorio. Agradecemos a la Dra. Christine Holt, en cuyo laboratorio se desarrolló por primera vez esta técnica de microinyección/lipofección de ADN en embriones de Xenopus.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Micropipetas de 3.5" | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Versión 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| Scion Corporation | CFW-1312 M | ||
| Chorulon (Gonadotropina Coriónica Humana) | AtoZ Vet Supply | N/A Cisteína | |
| Sigma-Aldrich | 168149-100G | ||
| DOTAP | Pinzas Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont #5 | Herramientas de ciencia fina | 11250-10 | |
| Microscopio de efluorescencia Eclipse E800 | de Nikon | : Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Versión 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creativo Nube) | Adobe | ||
| ImageJ (Versión 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulador con adaptador universal y base de soporte | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Extractor de micropipetas | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Instrumentación científica aplicada | motorizada de etapa z | MFC-2000 | |
| Inyector Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (versión 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embriones | Nasco LM00490 |
Referencias
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: d....
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Reimpresiones y permisos
