Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

Summary

Aquí, presentamos un protocolo de prueba de inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina.

Abstract

Una de las principales modalidades diagnósticas para la rabia es la detección del complejo de ribonucleoproteína viral (RNP) (antígeno) en las muestras de tejido infectadas. Si bien la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) o la prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) se utilizan con mayor frecuencia para la detección de antígenos, ambas pruebas requieren tejidos frescos y / o congelados para impresiones en diapositivas antes de la detección de antígenos con anticuerpos. Si las muestras se recogen y se fijan en formalina, ninguna de las pruebas es óptima para la detección de antígenos, sin embargo, las pruebas se pueden realizar mediante inmunohistoquímica convencional (IHC) después de incrustar en bloques de parafina y seccionamiento. Con este método IHC, los tejidos se tiñen con anticuerpos antirrábicos, las secciones se desparafinan, el antígeno se recupera mediante proteólisis parcial u otros métodos, y se incuba con anticuerpos primarios y secundarios. Los antígenos se tiñen con peroxidasa de rábano picante / amino etil carbazol y se contrateñen con hematoxilina para la visualización utilizando un microscopio de luz. Además de la detección específica de antígenos, la fijación de formalina ofrece otras ventajas como la determinación de cambios histológicos, condiciones relajadas para el almacenamiento y transporte de muestras (bajo temperatura ambiente), capacidad para probar casos retrospectivos y una mayor seguridad biológica a través de la inactivación de agentes infecciosos.

Introduction

La rabia es una encefalitis progresiva aguda causada por los virus de ARN de sentido negativo pertenecientes al género lyssavirus¹. Casi el 99% de todas las muertes humanas causadas por la infección con el virus de la rabia (RABV), el miembro tipo del género, es transmitida por perros². El diagnóstico de rabia de animales sospechosos se basa en la detección de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viralmente, proteína N) en complejo con ARN genómico (complejo ribonucleoproteína, RNP) en el tejido cerebral³. La detección de antígenos mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes dire....

Protocol

Si bien el protocolo IHC se realizó en tejidos fijos con formalina, que inactiva el RABV si está presente, se deben seguir adecuadamente los protocolos de bioseguridad apropiados. Todos los procedimientos de bioseguridad se describen en la 5ª edición de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluido el uso de equipo de protección personal (EPP) adecuado y el requisito de vacunación como se describe¹². Además, se debe seguir la contención y el manejo adecuados de productos químicos peligrosos (como formalina, AEC y xileno) (por ejemplo, campanas extractoras).....

Results

La Figura 2 muestra resultados representativos de tinción de IHC de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales analizados. La Figura 2A, D, G representa muestras positivas a 200x, mientras que la Figura 2B, E, H corresponde a un aumento de 400x, respectivamente. Figura 2A-C corresponden al.......

Discussion

Debido a la alta tasa de mortalidad de la rabia después del inicio de los síntomas, el diagnóstico de animales sospechosos de infección por RABV es extremadamente crítico para un tratamiento profiláctico adecuado después de la exposición. El diagnóstico de la rabia depende principalmente de técnicas basadas en DFA, DRIT y PCR que utilizan tejidos frescos o congelados. Para las pruebas de tejidos fijos con formalina, la prueba IHC proporciona un método alternativo para la detección sensible y específica del antígeno RABV........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3% peróxido de hidrógeno Marcas		Pharamacy	Listo para usar 3% H2O2
3-amino-9-etilcarbazol (AEC)	Millipore Sigma	A6926
Tampón de acetato pH 5.2	Poly Scientific R& D Corp.	s140
Formalina tamponada 10% Fosfato tamponado	Fisher Scientific	SF100-4	Certified
Cubreobjetos Corning	Fisher Scientific	12-553-471	24 X 50 mm
Etanol 190 Proof	Pharmco-AAPER	111000190
Etanol 200 Proof	Pharmco-AAPER	111000200
Formulación de hematoxilina de Gill #2	Fisher Scientific	CS401-1D
HistoMark Biotina-Estreptavidina Peroxidasa Kit	seracare	71-00-18	Anticuerpo primario de ratón
ImmunoHistoMount	Millipore Sigma	i1161	Medios
de montaje N,N, Dimetilformamida GR	Fisher Scientific	D119
Solución salina tamponada con fosfato	HyClone	RR14440.01	01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objetivo	Múltiples proveedores
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objetivo	Múltiples proveedores
Pronase	Millipore Sigma	53702	Proteasa, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water	Investigación y análisis de Poly Scientific D Corp.	s1887
Tissue-Tek Juego de tinciones Slide	Fisher Scientific	50-294-72
TWEEN-80	Millipore Sigma	P1754
Xileno	Fisher Scientific	X3S-4	Grado histológico
Zeiss Axioplan 2 imágenes - microscopio	Múltiples proveedores