Comportamiento de la construcción de nidos como un indicador temprano de los déficits conductuales en ratones

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar el comportamiento de la construcción de nidos en ratones, que se sabe que está deteriorado en varios trastornos neurológicos y enfermedades. Este protocolo examina la utilidad de cuatro materiales y ofrece la oportunidad de cuantificar el acuerdo de tarifador en puntuación, mejorando la validez y fiabilidad del ensayo.

Resumen

La construcción de nidos es un comportamiento innato en roedores machos y hembras, incluso cuando se crían en entornos de laboratorio. Como tal, muchos investigadores proporcionan roedores materiales sintéticos y/o naturales (como cordel, tejido, algodón, papel y heno) como un indicador de su bienestar general y como una evaluación auxiliar para predecir la posible disminución de la cognición. Normalmente, los cambios en los comportamientos de anidamiento, como la falta de creación de un nido, indican un cambio en la salud o el bienestar. Además, el comportamiento de anidación es sensible a muchos desafíos ambientales y fisiológicos, así como a muchas mutaciones genéticas subyacentes a los estados de enfermedades patológicas. El protocolo siguiente describe un paradigma de comportamiento de anidamiento que explora el uso de cuatro tipos de material de anidamiento. Además, el protocolo utiliza correlaciones intraclase para demostrar que la fiabilidad entre clasificadores es mayor cuando los nidos se construyen con papel triturado en comparación con otros materiales de anidamiento comunes, como cuadrados de algodón, giros de papel y mazorcablanda blanda Cama. La metodología elegida y las consideraciones estadísticas (es decir, correlación intraclase) para este ensayo pueden ser de interés para aquellos que realizan experimentos que evalúan la calidad de vida de los ratones.

Introducción

La construcción de nidos es un comportamiento innato en muchos animales como aves, peces, roedores y grandes simios, y está atrayendo más atención por su potencial utilidad en el estudio de enfermedades neurológicas y trastornos caracterizados por disminución del bienestar y deterioro actividades de la vida diaria¹. Los ratones, tanto machos como hembras, construyen nidos de tamaño similar con fines reproductivos, conservación del calor y refugio; lo que es más importante, siguen haciéndolo incluso cuando se crían en entornos de laboratorio². Hess, Petrovich y Goodwin³ sostienen que los estímulos biológicamente apropiados son primordiales para inducir comportamientos biológicamente apropiados, como anidar; sin embargo, una variedad de materiales naturales y artificiales, tales como heno, cáñamo, cordel de algodón, tiras de papel, bolas dentales de algodón, y cuadrados de algodón prensado, se han utilizado para evaluar el comportamiento de la construcción de nidos². Los cambios en estos comportamientos de anidamiento (es decir, la falta de creación de un nido a partir del material proporcionado) generalmente indican un cambio en la salud o el bienestar. En la mayoría de los casos, la falta de construcción de nidos se atribuye a varios factores que afectan negativamente el bienestar. Tales ejemplos que han disminuido efectivamente la calidad de la construcción de nidos en ratones incluyen temperaturas extremas; estimulación dolorosa; enfermedade inducida y la infección; mutaciones genéticas; y lesiones cerebrales en las áreas preópticas mediales, tabique e hipocampo^4,5,6.

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa progresiva caracterizada por la pérdida de tejido cerebral, la acumulación de placas extracelulares amiloide y enredos neurofibrilares intracelulares compuestos con microtúbulos hiperfosforilados proteína, tau⁷. Además, la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por, sobre todo, déficits en el aprendizaje y la memoria y deterioros de las actividades de la vida diaria. En ratones, las actividades de la vida diaria se examinan comúnmente a través de la carrera de ruedas circadiana^8,9,10,11, aunque nuevas alternativas, como la anidación, están creciendo en popularidad. Se ha demostrado que la anidación es sensible a las manipulaciones (por ejemplo, mutaciones genéticas, factores estresantes ambientales) que se han identificado como factores de riesgo y/o causas de la enfermedad de Alzheimer. Como tal, anidación se puede utilizar como un ensayo adicional o complementario en muchas cepas de ratón que modelan esas características de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, Deacon y sus colegas^{midieron la} construcción de nidos de ratones Tg2576 con la proteína precursora de amiloide sueco (APPswe) y las mutaciones genéticas de presenilinitina 1 (PS1). La calidad de los nidos construidos por ratones Tg2576 alojados en grupo fue significativamente peor que los controles de tipo salvaje a los 3 y 12 meses de edad. De acuerdo con estos hallazgos, Filali et al.¹³ informaron que los ratones machos alojados por separado recibieron dos piezas de 5 x 5 cm de algodón construidas significativamente nidos más pobres como clasificados en una escala de 1 - 5 (1 - nestlet no tocado, 5 - un nido casi perfecto). Los ratones transgénicos construyeron constantemente nidos peores a los 6, 9 y 12 meses de edad en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje, y en algunos casos, los ratones Appswe/PS1 no lograron construir un nido a partir del algodón proporcionado.

Investigaciones anteriores de nuestro laboratorio han demostrado que los ratones de tipo salvaje C57BL/6J construyen nidos significativamente mejores a partir de cuadrados de algodón en comparación con los ratones CRND8 y CRND8/E4^9. Sin embargo, la mayoría de los experimentos con cuadrados de algodón prensado parecen ser variables, con ratones de tipo salvaje que no muestran las puntuaciones altas esperadas en comparación con los ratones transgénicos que se espera que muestren puntuaciones muy bajas en la anidación², lo que en parte puede conducir a una la falta de diferencias en los parámetros estimados (es decir, las diferencias medias) y la significancia estadística. La falta de diferencias puede deberse en parte al envejecimiento inadecuado de los ratones o al tiempo asignado para la anidación. Alternativamente, el material de anidamiento puede ser un desafío adicional, lo que resulta en una mayor variabilidad debido a las preferencias metodológicas de los investigadores en la cantidad y el tipo de material, que incluso puede interactuar con la tensión del ratón. Por ejemplo, Robinson-Junker y sus colegas¹⁴ proporcionaron material de cama procesado o sin procesar de diferentes tamaños (es decir, escamas pequeñas o grandes) a ratones C3H/HeNCrl y ratones BALB/cAnNCrl, que se observan comúnmente, respectivamente, como ratones pobres y fuertes constructores de nidos. Cuando se proporciona ropa de cama sin procesar, los ratones C3H construyeron nidos menos complejos, pero similares en calidad en comparación con los de los ratones BALB/c.  Del mismo modo, Martin y sus colegas¹⁵ compararon la complejidad de los nidos de diferentes materiales de anidación dados a ratones de ciervos, un pariente lejano de las especies de Mus musculus que tienen diferencias evolutivas distintas (es decir, más propensos a cavar en los árboles y maleza y son más activos en cautiverio), pero reciben cuidados de cría similares a los ratones de laboratorio comunes y construyen nidos a partir de cualquier material blando y fibroso disponible^16,17,18.  Las hembras y criadores con cachorros en la jaula de origen construyeron nidos más complejos que los machos, y los autores sugieren que estas diferencias de comportamiento pueden deberse a cambios asociados en las concentraciones de progesterona en ratones ciervos^15. Más importante aún, los ratones construyeron nidos más complejos compuestos de papel marrón seguido de cuadrados de algodón y cilindros de algodón, y los nidos menos complejos fueron construidos con papel blanco y cuadrados mini-algodón dispersos.

A pesar de la creciente popularidad de la anidación, las consideraciones con respecto a las prácticas científicamente válidas, rentables y sensibles al tiempo se discuten mínimamente. Dados los desafíos metodológicos y económicos antes mencionados, este protocolo investiga la utilidad de diferentes materiales de anidación ( cuadrados de algodón, giros de papel, papel triturado y ropa de cama procesada) en el comportamiento de anidación. Específicamente, proporcionamos todos los materiales de anidación tanto a los controles de tipo silvestre C57BL/6J de edad como a los ratones APOE e4 de la enfermedad de Alzheimer con el fin de investigar cualquier genotipo potencial mediante interacciones materiales en la calidad de anidación. Además, el experimento buscó evaluar la fiabilidad entre tipos de los nidos construidos a partir de diferentes materiales. En conjunto, este protocolo demuestra la superioridad de un material de anidación en esta muestra , papel triturado, en términos de calidad de nido y acuerdo de puntuador, con la intención de mejorar la validez y fiabilidad del ensayo de anidación.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad George Mason y están de acuerdo con las pautas establecidas por la Evaluación y Acreditación del Cuidado De los Animales de Laboratorio.

1. Animales y consideraciones antes de la evaluación

1. Para este protocolo, utilice ratones de tipo salvaje adultos, de 9 a 12 meses de edad C57BL/6J (n a 10) (stock 000664) y ratones APOE e4 (n.o 11) de un cruce hemizygous J20 (stock #006293) x homocigoto APOE e4 (stock #012307).
2. En la sala de alojamiento, ratones de casa de grupo con camadas del mismo sexo con un enriquecimiento adecuado (por ejemplo, para este protocolo, a los ratones se les proporcionó una rueda de correr, iglú y un pequeño juguete de masticación de nylon). Casa de grupo 4 - 6 ratones hembra, y 4 machos en una jaula casera de 356 mm L x 485 mm W x 218 mm H.
   NOTA: Los investigadores pueden considerar la implementación de estrategias antes y/o después de anidar con el fin de evitar la agresión de la pareja de jaulas cuando los ratones son reintroducidos después de los ensayos de anidación. Tales estrategias pueden incluir, pero no se limitan a, el manejo diario antes de las pruebas de comportamiento para aclimatar mejor a los ratones a la manipulación durante las pruebas de comportamiento, investigadores, y el personal de cría¹⁹, separar y albergar individualmente ratones agresivos, o reducir el número de ratones en la jaula^20,dependiendo de la gravedad de los combates en jaulas, las heridas observadas^21,etc.

2. Configuración de la habitación y la anidación

1. Asegúrese de que cada ratón complete cuatro ensayos (1 material por ensayo). Aleatorizar el orden del material de anidamiento para cada ratón para evitar un efecto de orden.
2. Prepare las jaulas en una sala de pruebas separada. Registre las condiciones ambientales (por ejemplo, 22,2 – 22,3 oC, 45-47% de humedad, luces en 9:00 AM – 9:00 PM) de manera que sean consistentes en todos los ensayos y sean idénticas a la sala de alojamiento. Proporcionar alimentos y agua ad libitum.
   1. Asigne a cada ratón un número o letra de identificación aleatoria (ID). Fije la tarjeta de identificador aleatorio a una jaula de 29,2 x 18,4 cm.
   2. Registre el documento de identidad/etiqueta original del animal y otra identificación necesaria en un registro de colonia para asegurarse de que los asistentes y el personal de cría de animales permanezcan ciegos a las condiciones.
3. Ordene aleatoriamente la colocación de jaulas en la sala de pruebas, de modo que los ratones de tipo salvaje y transgénicono no estén separados de manera inapropiada (es decir, en lados opuestos de la sala, en estantes separados, etc.).
4. Prepare los materiales de anidación cubriendo lo suficiente el fondo de la jaula. Utilice aproximadamente 100 g de peso seco de la ropa de cama de mazorca de maíz para los ensayos de papel cuadrado, torcido y rallado, y aproximadamente 100 g de la ropa de cama con mazorca blanda para el ensayo de mazorca blanda.
5. Si utiliza un vaso de precipitados para dispersar el material de anidación, llene el vaso de precipitados no más de 100 ml con ropa de cama de mazorca de maíz o ropa de cama con mazorca blanda.
6. Coloque el primer material de anidamiento en la secuencia antes de introducir el ratón en la jaula. Este protocolo utilizaba (1) un único cuadrado de algodón prensado, (2) un solo giro de papel, (3) 100 g de ropa de cama de mazorca blanda solamente (es decir, sin ropa de cama adicional o material de anidamiento añadido), y (4) 2,5 g de papel limpio (sin tinta), papel de impresora blanco triturado en tiras de 5 a 7 cm. Disperse los materiales de anidamiento como se muestra en la Figura 1 (línea de base).

Figura 1: Configuración de la jaula para cada material. Todos los ratones completaron un ensayo con cada tipo de material para un total de cuatro ensayos. La ropa de cama Corncob forró toda la parte inferior de las jaulas que contenían un giro de papel, un cuadrado de algodón prensado y papel rallado. La ropa de cama de mazorca suave se dispersó uniformemente a través de la jaula para alentar a los ratones a separar los pequeños cuadrados de algodón de la mazorca de maíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Prueba de anidamiento

1. Comience la primera prueba de anidamiento a la misma hora del día al inicio del ciclo de luz (por ejemplo, 9:00 AM).
2. Lleve la jaula que contiene a los ratones a la sala de pruebas. Retire cada ratón de la jaula y colóquelo en su jaula de anidación asignada con el material ya colocado en la jaula. Devuelva las jaulas a la sala de alojamiento.
3. Permita que los ratones completen 1 ensayo durante 24 horas sin interrupciones.
4. 24 h después del inicio de la primera prueba, regrese a la sala de pruebas.
5. Retire cuidadosamente la tapa de la jaula y fotografíe el nido de cada ratón, capturando el documento de identidad asignado en la fotografía y minimizando la apariencia de cualquier material fuera de la jaula.
   NOTA: Espere a que el ratón se mueva del nido antes de intentar retirarlo de la jaula. Se recomienda encarecidamente fotografiar el nido mientras el ratón está en la jaula pero fuera del nido. Intentar quitar el ratón de la jaula antes de fotografiar puede causar que el ratón se asuste, así se mueve sobre los materiales de anidación y se dispersa.
6. Retire suavemente el ratón de la jaula de anidación y colóquelo en una jaula de sujeción temporal. Deseche la ropa de cama y los materiales de anidamiento, reemplace la ropa de cama y proporcione el siguiente material de anidamiento en la secuencia y devuelva el ratón a la jaula de anidación.
7. Repita según sea necesario para obtener puntuaciones para las 4 pruebas. Se recomienda utilizar papel triturado y los criterios de puntuación que lo acompañan, aunque los investigadores pueden estar interesados en utilizar los materiales alternativos discutidos en este protocolo.
8. Cuando todas las pruebas estén completas, devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas. Observe a los ratones para detectar cualquier comportamiento agresivo potencial. La agresión puede ocurrir en machos de tipo salvaje más viejos.
   NOTA: Para los fines de este protocolo, los ratones fueron probados una vez a los aproximadamente 9 – 12 meses de edad. La anidación debe llevarse a cabo a varias edades (es decir, a una edad más temprana, dependiendo de la cepa elegida, antes de la aparición de rasgos fenotípicos) para documentar la disminución de la capacidad de anidación a lo largo del tiempo y demostrar el probable papel causal de la neurodegeneración.

4. Puntuación y evaluación de la fiabilidad entre solicitantes

1. Proporcione imágenes de línea base para cada material de anidamiento a al menos 2 personas ciegas al estudio. Aunque no es necesario, asegúrese de que los anotadores estén familiarizados con el concepto de anidamiento. Al entrenar a los anotadores, proporcione una serie de nidos de ejemplo (por ejemplo, la Figura 2 para el papel triturado) para familiarizar a los anotadores con cada tipo de material (si corresponde) y los criterios de puntuación.
   1. Evalúe cada nido en una escala de 1 a 5 utilizando la siguiente información de escala (adaptada desde Deacon, 2006)². Vea la Figura 2 como puntuación de ejemplo utilizando papel triturado.
   2. Asigne una puntuación de 1 cuando el papel rallado o los cuadrados pequeños permanecieran esparcidos por toda la jaula, o el cuadrado o torsión de algodón permanecieron intactos;
   3. Asignar una puntuación de 2 cuando parte del material fue construido en un nido, pero más del 50% del material no se utilizó para la construcción del nido (es decir, permaneció disperso o la mayoría del material original permaneció intacto);
   4. Asigne una puntuación de 3 cuando se construyó un nido notable, pero varias piezas todavía estaban dispersas;
   5. Asigne una puntuación de 4 cuando casi todo el material se utilizó para el nido, pero pocas piezas de material permanecieron dispersas o estaban cerca del nido;
   6. Asigne una puntuación de 5 cuando todo el material se utilizó para hacer un nido identificable.
      NOTA: Los anotadores deben tomar descansos y volver a visitar las fotos de línea de base para evitar fatiga y sesgo durante el procedimiento de puntuación. Los anotadores no deben discutir las puntuaciones entre sí para evitar sesgos. Los marcadores deben discutir las puntuaciones después de que se complete la puntuación, o si se necesita una discusión adicional para cambiar las puntuaciones, lo que potencialmente puede resolver problemas con correlaciones intraclase (ICC). Las correlaciones intraclase se llevarán a cabo utilizando los pasos enumerados en la sección 4.2.

Figura 2: Ejemplo de puntuación utilizando los criterios para papel triturado, el material preferido. De izquierda a derecha: 1 – el papel rallado permanecía intacto; 2 – parte del papel fue construido en un nido, pero la mayoría de las piezas permanecieron dispersas; 3 – se construyó un nido notable, pero varias piezas todavía estaban dispersas; 4 – la mayoría de las piezas se utilizaron para el nido, pero algunas piezas se esparcieron cerca del nido; 5 – todas las piezas se utilizaron para hacer el nido. Tenga en cuenta que en las fotografías, el número asignado del animal se muestra para evitar la descelación. El color de la tarjeta es aleatorio. Los investigadores deben permitir que el ratón permanezca en la jaula para evitar el sorprendente ratón, lo que potencialmente podría dispersar el nido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Recopile y introduzca puntuaciones y formatee el archivo de datos de forma que las puntuaciones de cada marcador para cada material estén en columnas separadas.
   NOTA: Si utiliza el archivo complementario 1, tenga en cuenta que el script de codificación para este análisis requiere softwares libres de código abierto (por ejemplo, paquete irr en RStudio)^22,23. El script elimina los encabezados y las variables de sujeto (es decir, la fila superior y los identificadores de animales) para llevar a cabo la correlación intraclase (ICC). Ejecute el script para llevar a cabo un acuerdo bidireccional y promedia las medidas DE ICC resaltando la sección demarcada del código y pulsando Ctrl+Intro o Comando+Intro.
3. Compare la CPI con los criterios existentes^24,25,26. Típicamente, los valores ICC por encima de 0.80 corresponden a una fuerte confiabilidad entre tasadores, justificando las puntuaciones que se promediarán en un momento dado(Archivo Suplementario 2).
4. Utilice los mismos criterios ICC para la confiabilidad intrarrate, que puede ser de interés para aquellos que realizan la puntuación por primera vez.
   ADVERTENCIA: Los anotadores deben puntuar los mismos nidos fotografiados dentro de una semana de la evaluación inicial. Proceda con precaución con el promedio de datos cuando la CPI es baja, ya que esto puede sesgar los datos o producir hallazgos nulos. Si los valores de la CPI son bajos, entonces (1) se puede requerir capacitación adicional para los goleadores, (2) los goleadores pueden necesitar discutir su razonamiento para las puntuaciones de los nidos, (3) otro revisor independiente puede ser necesario para hacer una llamada de juicio con respecto a las puntuaciones, o (4) intra-rater fiabilidad puede necesitar ser evaluada. Si la confiabilidad intra-rater es pobre, entonces se puede requerir entrenamiento adicional o un marcador diferente.

5. Consideraciones estadísticas

1. Realizar análisis estadísticos, según corresponda. Para los datos que no infringen los supuestos de normalidad pero utilizan varios materiales para cada ratón (es decir, un efecto dentro de los sujetos), utilice un análisis mixto de varianza (ANOVA).
   1. Si utiliza códigos proporcionados como archivos suplementarios, descargue paquetes adicionales adicionales que se especifican en el script^27,28,29,30.
   2. Si realiza un ANOVA mixto utilizando el script proporcionado, ejecute el script para convertir cualquier archivo de datos de formato ancho en formato largo (es decir, en lugar de variables repetidas en columnas, convierta las celdas en repetición en filas). En este manuscrito se incluye un archivo de datos de ejemplo para demostrar cómo convertir un archivo de datos de formato ancho a formato largo.
   3. Lleve a cabo el ANOVA mixto, como se especifica en el script. Tenga en cuenta que si se infringe la prueba de esfhericidad de Mauchly, implemente factores de corrección como la corrección de gases de efecto invernadero.
   4. Realice las pruebas posthoc necesarias para examinar las diferencias entre los factores con más de 2 niveles, como se especifica en el script de codificación. En este ejemplo, realice pruebas posthoc de Bonferroni para comparar los diferentes tipos de material de anidamiento.
      NOTA: Si solo se utiliza un material de anidamiento, no incorpore un factor dentro de los sujetos. Sin embargo, si recopila datos en varios momentos, incorpore estas medidas repetidas como si los niveles de un factor dentro de los sujetos.
      NOTA: En algunos casos, los ratones de tipo salvaje pueden tener puntuaciones perfectas y por lo tanto exhibirán un efecto de techo, lo que conduce a una distribución no normal². Considere las pruebas estadísticas apropiadas (por ejemplo, pruebas no paramétricas con medidas alternativas de tendencia central y dispersión), métodos de normalización o enfoques robustos (modelos de efectos mixtos para medidas repetidas) al analizar datos.

Resultados

Los resultados de los cuatro materiales de anidación diferentes proporcionados a ratones de tipo salvaje y APOE e4 se explican de la siguiente manera. Sobre la base de los criterios existentes, la CPI mostró un fuerte acuerdo entre los tres codificadores para los cuatro materiales de anidación (papel triturado ICC - 0,94; ICC cuadrado - 0,91; ropa de cama ICC - 0,87; torsión ICC - 0,87); por lo tanto, las tres puntuaciones se promediaron juntas para crear una puntuación única para cada material proporcionado. Un ANOVA mixto de 2 x 4 produjo un efecto principal significativo del genotipo, F(1, 19) a 31,30, p < 0,01, áp² a 0,62. En los cuatro materiales proporcionados, los ratones de tipo silvestre obtuvieron una puntuación más alta en la calidad de los nidos (3,18 x 0,20) en comparación con los ratones APOE e4 (1,98 x 0,16). Además, el ANOVA mixto produjo un efecto principal significativo del material, F(3, 57) a 57,48, p < 0,01, áp² a 0,75. Las comparaciones por pares con la corrección de Bonferroni mostraron que el papel triturado (4,11 x 0,20) fue clasificado significativamente más alto(p < 0,05) en calidad que el cuadrado (1,95 x 0,21), ropa de cama (2,21 a 0,21), o los materiales de torsión (1,94 a 0,20), sin diferencias entre el cuadrado, la ropa de cama y los materiales de torsión (todos p > 0,99). No hubo ninguna interacción significativa entre el genotipo y el material. Los datos se muestran en la Figura 3.

Otros experimentos de nuestro laboratorio han dado resultados similares en modelos de aparición temprana de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 4, 5,5 meses de edad P301L rTg4510 (htau) ratones construidos anidares significativamente peores a partir de papel triturado en comparación con sus homólogos de tipo salvaje coincidentes con la edad³¹. Del mismo modo, los ratones J20 (hAPP)/htau y htau individuales construyeron nidos más pobres con papel triturado en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje y SÓLO DE CAMKIIa-promoter, tanto a 3,5 como a 7 meses de edad³² (datos no mostrados).

Figura 3: Calidad nominal de los nidos hechos de diferentes materiales proporcionados a ratones de tipo salvaje y APOE e4. Un efecto principal del genotipo (*p < 0.01) demostró que los ratones de tipo salvaje construyeron consistentemente mejores nidos hechos de papel triturado, cuadrados de algodón prensado, torsión de papel y ropa de cama de mazorca suave en comparación con ratones APOE e4. El efecto principal del material (**p < 0.01) también demostró que los nidos construidos a partir del papel triturado fueron clasificados de mayor calidad en comparación con los otros tres materiales. El papel triturado tenía la medida de confiabilidad interevaluada más alta evaluada por la CPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Nidos depapel triturados construidos por ratones de tipo salvaje y htau, en o fuera del agua de zinc. (A) Nidos representativos construidos por ratones de 5,5 meses de edad silvestres y htau, en el control (tap) de agua o agua complementada con 10 partes por millón zinc (un biometal implicado en la enfermedad de Alzheimer). Los nidos se puntuaron en la escala 1 -5 utilizando los criterios especificados. De izquierda a derecha: tipo salvaje + agua de zinc (4,54 x 0,52); tipo salvaje + agua de control (4,15 x 0,80); htau + agua de control (3,08 x 0,64); htau + agua de zinc (2,46 x 0,97). (B) Una interacción genotipo*agua demostró que los ratones htau en agua de zinc construyeron nidos significativamente peores en comparación con los otros grupos (*); además, los efectos simples mostraron que los ratones htau en el agua de zinc construyeron nidos peores que los ratones htau en el agua de control. Ratones de tipo salvaje en agua de control y nidos de zinc construidos por agua de mayor calidad, en comparación con sus homólogos de htau. Reimpreso de Journal of Alzheimer's Disease, Vol 64, Craven, KM, Kochen WR, Hernández CM, Flinn JM, Zinc Exacerbates Tau Pathology in a Tau Mouse Model, 671-630, Copyright (2018), con permiso de IOS Press³¹. La publicación está disponible en IOS Press a través de http://dx.doi.org/10.3233/JAD-180151. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo Suplementario 1: Archivo de codificación suplementario – anidamiento. R Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo Suplementario 2: AD Study nesting scores.csv Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La anidación es un comportamiento de roedor evolutivamente importante y se ha utilizado para evaluar la actividad de la vida diaria y el bienestar general en ratones^2. La facilidad para llevar a cabo la prueba, su fiabilidad y su validez facial hacen que anidar sea un complemento práctico para muchas pruebas conductuales como la madriguera, el ritmo circadiano y el aseo. Pero, a medida que la anidación se utiliza más comúnmente en el laboratorio, las diversas combinaciones para conducir, cuantificar e interpretar el anidamiento aumentan. Como tal, se necesitan más investigaciones para explorar los mejores procedimientos metodológica y prácticamente sólidos para anidar, de modo que la validez y fiabilidad del ensayo no se sacrifiquen por los costos, el tiempo de prueba y otros procedimientos que reducen la carga de prueba .

La calidad de la construcción de nidos es de hecho sensible al tipo de ropa de cama proporcionada, así como al genotipo. En general, ratones de tipo salvaje construyeron nidos significativamente mejores en comparación con los ratones APOE e4 independientemente del material de anidación; sin embargo, tanto los ratones wildtype como los ratones APOE e4 construyen nidos de mayor calidad a partir de papel triturado en comparación con los otros tres materiales de anidación. Otros estudios proporcionan evidencia corroborante con respecto al papel triturado: los ratones construyeron nidos más complejos a partir de tiras de papel trituradas que con cuadrados de algodón prensado, tejido y ropa de cama de álamo^33. Además, los nidos construidos a partir de tiras de papel trituradas han sido evaluados cualitativamente como más "naturalistas" que los hechos de otros materiales, que se caracterizan por la forma del nido en sí y la altura de las paredes alrededor de la cavidad del nido en para formar una cúpula^6,33. Como tal, la selección de material adecuado para este ensayo es crítica con el fin de observar mejor el comportamiento natural en un entorno relativamente controlado, es decir, el entorno de laboratorio. Más importante aún, aunque este protocolo evaluó la anidación una vez a los 9–12 meses de edad, enfatizamos que la anidación debe llevarse a cabo a varias edades. La simplicidad de este protocolo permite que se lleve a cabo varias veces, idealmente antes de la aparición de déficits que acompañan a la neurodegeneración. Las mediciones repetidas ofrecen la oportunidad de documentar el probable papel causal de la neurodegeneración en la disminución de la capacidad de anidación.

Se ha demostrado que la construcción de nidos naturales difiere entre los ratones de diferentes cepas de fondo^34,y como tal, la calidad general y la forma del nido pueden diferir no debido al transgén de interés, sino debido a la cepa de fondo. Por ejemplo, los ancestros de los ratones C57BL/6 fueron considerados anidadores "agujeros", mientras que los ancestros de los ratones BALB/C fueron considerados "superficiales" anidadores^35. Los ratones en el fondo C3H o cruces con esta cepa, como el híbrido C3H/He-C57BL/6 con E4 utilizado en Graybeal et al.⁹ también se consideran anidadores pobres; por lo tanto, los investigadores deberían considerar fuertemente el uso de ratones de control en el mismo fondo que los ratones transgénicos, lo que mejoraría en general el papel directo y causal de los transgénicos, en lugar de los antecedentes, en la neurodegeneración y los déficits subsiguientes en el nido comportamiento de construcción.

Algunos experimentos a menudo utilizan un solo marcador para juzgar cualitativamente la complejidad del nido; sin embargo, hacemos el argumento de incluir más goleadores, y lo que es más importante, a los goleadores ciegos a las condiciones experimentales. A través de este enfoque, utilizamos tres marcadores independientes y ciegos y una correlación intraclase para evaluar el acuerdo entre los anotadores, que, con la formación básica, produjeron correlaciones intraclase altas que eran indicativas de una alta fiabilidad entre los calificadores y un fuerte acuerdo con respecto a la calidad de los nidos. Además, decenas de nidos compuestos de papel triturado y cuadrados de algodón tenían las correlaciones intraclase más altas, una indicación de un acuerdo más fuerte y una mayor consistencia entre los goleadores. El acuerdo fuerte también proporciona justificación para promediar las múltiples puntuaciones juntas, una estrategia implementada de forma azarosa en la investigación conductual. Aunque esta estrategia requiere más individuos y, presumiblemente, más tiempo para puntuar nidos, reduce eficazmente el sesgo en las evaluaciones cualitativas como el anidamiento.

Los materiales de anidación utilizados en este ensayo eran aproximadamente iguales en precio, excepto para la ropa de cama de mazorca blanda. La ropa de cama comercial para anidar puede ser económicamente ingeniosa para algunos experimentadores; sin embargo, Martin et al.¹⁵ señalan que los cuadrados de algodón, en comparación con otros materiales como el papel arrugado, es uno de los materiales más caros disponibles para la compra. Esto puede deberse a la fácil disponibilidad, almacenamiento y administración, pero otros investigadores pueden optar por materiales igualmente válidos y confiables, especialmente cuando son desafiados por un gran número de animales en una instalación, el número de ensayos de anidación, las restricciones de tiempo para aniestas y altos costos de jaula. Por lo tanto, el papel triturado puede ser una opción más factible y apropiada. Además, la captura de datos para nuestro método se puede llevar a cabo inmediatamente (es decir, puntuación en persona), aunque las fotografías deben ser muy consideradas para registrar, guardar y volver a cuantificar nidos, si se desea a los efectos de evaluar entre fiabilidad en momentos posteriores. Como se ha señalado, hacemos hincapié en la inclusión de múltiples anotadores para las prácticas de "prueba, reevaluación" para evaluar el acuerdo, ya que estos procedimientos metodológicamente sólidos a menudo se pasan por alto.

En conclusión, creemos que la metodología y las consideraciones estadísticas (es decir, la correlación intraclase) para este ensayo pueden ser de interés para los experimentos que evalúan la calidad de vida, el bienestar general y las actividades de la vida diaria en ratones.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ropa de cama de mazorca de maíz	Envigo	7092	1/8 en ropa de cama para cuadrados de algodón, papel triturado y pruebas de torsión
de papel Cuadrados de algodón	Envigo	Iso-Blox
Diamond Twists Envigo		7979C.CS	Giros de papel utilizados en el protocolo
Ratón - APOE4 e4	Jackson Laboratories	#012307	Homocigoto Ratón APEO4 e4 criado con el ratón
Ratón - C57BL/6J	Jackson Laboratories	#000664	Ratón de tipo salvaje para controles
Ratón - J20	Jackson Laboratories	#006293	Ratón hemizígoto criado con el ratón homocigoto APOE e4 para generar cruces
Rstudio	R Core Team	V1.1.463	Run con R versión 3.5.3 (2019-03-11) -- "Gran Verdad". Nota: los paquetes R adicionales se incluyen en el código proporcionado y se pueden instalar desde CRAN
Soft Cob	Envigo	7087C