Una dieta sin sangre para criar mosquitos anofelinas

Las enfermedades transmitidas por vectores afectan a varios millones de seres humanos en todo el mundo y causan millones de muertes cada año. Son transmitidos por insectos infectados con microorganismos que producen enfermedades (protozoos, virus) adquiridos cuando se alimentan de sangre de un huésped infectado. Posteriormente, el vector infectado transmitirá el patógeno a un nuevo huésped durante la siguiente comida de sangre. La malaria es la enfermedad transmitida por vectores más mortífera que se transmite por varias especies diferentes de mosquitos Anopheles y afecta al 40% de la población mundial¹. El parásito protista del paludismo es responsable de más de 400.000 muertes cada año, de las cuales la mayoría son niños menores de 5 años (Organización Mundial de la Salud). El mosquito hembra Anopheles transmite el parásito de la malaria del género Plasmodium entre humanos y otros animales cuando se alimenta de sangre vertebrada, un paso necesario para la producción y desarrollo de óvulos^2.

Las estrategias actuales para la erradicación del paludismo y otras enfermedades mortales emergentes transmitidas por mosquitos se basan en el desarrollo de estrategias innovadoras de control de mosquitos^3,4,5, que incluyen la liberación en la naturaleza de un gran número de mosquitos criados en insectarios. Sin embargo, un factor limitante crucial es la dependencia de un suministro de sangre fresca para la cría y la cría efectivas de mosquitos. La composición variable de la sangre de los vertebrados puede afectar negativamente a la fertilidad de los mosquitos y la aptitud de la progenie y puede limitar la fiabilidad y sostenibilidad de las colonias de cría en cautividad. Los programas de liberación y control de mosquitos requieren sistemas de producción de mosquitos a gran escala y un suministro regular de grandes cantidades de sangre de vertebrados. Este es un obstáculo importante para la producción de mosquitos y plantea una serie de cuestiones éticas relacionadas con el uso de animales vivos y limitaciones logísticas causadas por las exigentes regulaciones de seguridad asociadas. Esto hace que los costos de mantenimiento y seguridad de las colonias de mosquitos sean elevados y desafía la sostenibilidad de las prácticas actuales de cría de mosquitos, especialmente en los países de bajos ingresos donde la amenaza del paludismo es mucho mayor.

Recientemente la investigación se ha centrado en el desarrollo de sustitutos de la sangre que imitan una comida de sangre vertebrada pero hasta ahora, sólo se ha logrado un éxito limitado^6,7,8,9. Una dieta artificial exitosa necesita (1) provocar un engorgement completo de mosquitos hembra, (2) desencadenar la producción de vitellogenina, (3) producir grandes lotes de huevos viables, y (4) generar progenie pagana¹⁰. Además, las dietas artificiales tienen una composición estándar y por lo tanto son más fiables para la producción de mosquitos con fines de investigación y control. Se han desarrollado dietas exitosas sin sangre para los mosquitos Aedes (revisados por Gonzales y Hansen¹¹), pero no para Anopheles spp. Las dietas artificiales existentes contienen un fegoestimulante (por ejemplo, ATP¹⁰), una fuente de proteínapara la maduración de óvulos^6,12, como fuente de energía, y los aminoácidos (aa)¹³ que son fundamentales para la producción de óvulos. Una dieta artificial libre de sangre también necesita proporcionar colesterol¹⁵, que mejora la producción de huevos. Aquí describimos una dieta artificial libre de sangre para mosquitos Anopheles hembras y demostramos que tiene un rendimiento consistente y equivalente a una comida de sangre vertebrada de alta calidad.

Los ratones fueron obtenidos de la casa de animales IHMT. Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la ley portuguesa y las directrices para el uso de animales de laboratorio. El Dire-O-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural y das Pescas, Portugal aprobó todos los protocolos de estudio (aprobaciones de identificación: 023351 y 023355).

NOTA: Realice todos los ensayos de alimentación a 26 oC.

1. Mosquitos

1. Mantener aAnopheles coluzzii (antigua forma de Anopheles gambiae M) Mosquitos de cepa Yaundé a 26 oC, 75% de humedad bajo un ciclo de luz de 12 h:12 h: ciclo oscuro. Casa de mosquitos que utilizan condiciones insectarias estándar para garantizar el apareamiento.
2. Recoger las puas de mosquitos en un pequeño recipiente de agua. Coloque el recipiente dentro de una jaula de mosquitos para permitir que los mosquitos adultos emerjan y se apareen. Proporcionar un 10% de solución de alimentación de glucosa. Tres días después de la aparición recoger el número necesario de mosquitos de la jaula de almacenamiento utilizando un aspirador.
3. Un día antes de los ensayos de alimentación, retire la solución de alimentación de glucosa al 10%.
   NOTA: Se utilizaron 3 mosquitos de un día de edad durante todo el experimento.

2. Alimentación de mosquitos

1. Preparación de dietas líquidas artificiales
   1. Preparar las dietas líquidas artificiales en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar. Preparar la dieta líquida rica (r-liq_diet) añadiendo lo siguiente a la dieta líquida inicial (i-liq_diet; El medio de Eagle modificado de Dulbecco [glucosa alta con L-glutamina], ver Tabla 1:0,55 g/L ATP, 1 g/L de colesterol y 200 g/L de albúmina sérica bovina (BSA). Mezcle todos los ingredientes a fondo y filtre con un microfiltro de 0,45 m.
      NOTA: No almacene las dietas; preparar dietas recién a partir de las soluciones de stock para cada experimento, ya que pierden calidad cuando se almacenan. Los componentes de las dietas se describen en la Tabla 1.
2. Recolección de sangre de ratón
   1. Anestetizar 6 x 8 semanas de edad CD1 ratones hembra (Mus musculus) con ketamina (120 mg/kg) y xilazina (16 mg/kg) utilizando la vía intraperitoneal.
   2. Realizar punción cardíaca(Figura 1) cuando el ratón no muestra ninguna reacción muscular en respuesta a diferentes estímulos físicos (por ejemplo, pellizcos de dedo del dedo del sol y cola).
   3. Recoger sangre con una jeringa estéril de 1 ml con una aguja de 27 G x 1/2o (0,4 x 12 mm²) que contenga 100 ml de 1 mg/ml de heparina (sal sódica) para evitar la formación de coágulos sanguíneos. Mantener la sangre a 37 oC con un baño de agua.
3. Alimentación artificial
   1. Recoger aproximadamente 30 mosquitos hembra de la jaula de stock utilizando un aspirador.
   2. Transfiera los mosquitos hembra a tazas de papel de 500 ml y cúbralos con una fina malla de mosquitera para que no puedan escapar. Aplique un alimentador de vidrio conectado a tubos de plástico para mantener un flujo de agua constante en la parte superior de cada taza(Figura 2). Proporcione un flujo de agua constante al tubo cilíndrico y al alimentador para que la temperatura interior se mantenga a aproximadamente 37,5 oC.
      NOTA: Se utilizó un aparato de alimentación artificial de campana de vidrio estándar¹⁶ para suministrar las dietas formuladas a los mosquitos hembra.
   3. Estirar la membrana de la película de parafina a través de la boca del alimentador de vidrio para contener la comida.
   4. Precalentar la i-liq_diet y r-liq_diet a 37 oC utilizando un baño de agua. Aplique 1 ml en el alimentador de vidrio. Alimentar a los mosquitos durante 60 minutos en la oscuridad con i-liq_diet, r-liq_diet o sangre fresca de ratón. Realizar ensayos a 26oC.
4. Evaluación de la tasa de alimentación.
   1. Después de la alimentación artificial, anestetizar en frío los mosquitos a -20 oC durante 30 s. Coloque los mosquitos en un plato de Petri refrigerado.
   2. Registre el número de mosquitos hembra completamente engordados(Figura 3).
      NOTA: El porcentaje de mosquitos alimentados se utiliza como apoderado para el éxito de la alimentación.

3. Rasgos de la historia de la vida

1. Producción de huevos y fertilidad
   1. Transfiera las hembras completamente engordadas, usando un cepillo, a jaulas individuales (20 cm x 20 cm x 20 cm).
   2. Mantener los mosquitos a 26 oC, 75% de humedad y una luz de 12 h:12 h: ciclo oscuro con 10% de glucosa ad libitum.
   3. Cuarenta y ocho h después de la alimentación, añadir un papel de filtro humidificado en la parte inferior para la puesta de huevos(Figura 4). Cuente los huevos a las 48 h y 72 h después de la adición del papel de puesta de huevos utilizando una lupa de mano. Inundar el papel filtrante con agua destilada para recoger los huevos.
2. Mortalidad de larvas
   1. Recoger los huevos en bandejas (23 cm x 15 cm x 6 cm) llenas de agua destilada(Figura 5). Mantenga constante el nivel de agua en las bandejas durante los experimentos.
   2. Alimente las larvas diariamente con aproximadamente 13 mg de alimento de pescado molido por bandeja. Aplique un régimen de alimentación similar a todas las bandejas de réplica.
   3. Retire las pusilas muertas y las larvas diariamente. Finalizar los experimentos cuando todas las pupupas se han convertido en adultos y contar el número de machos y hembras adultos.
   4. Registre las fechas de eclosión y muerte y calcule las tasas de mortalidad.
3. Longevidad
   1. Recoger 15 machos adultos y 15 hembras adultas de la generación F1 de cada grupo de dieta. Mantenga a machos y hembras en la misma jaula.
   2. Alimente a los adultos con una solución de glucosa al 10% ad libitum. Retire a los adultos muertos todos los días.
   3. Mantener los mosquitos a la misma temperatura, humedad, condiciones del ciclo ligero y régimen de alimentación del azúcar como se describió anteriormente.
   4. Registre las fechas de defunción y calcule la longevidad.
4. Medición de la longitud del ala
   1. Anestetizar mosquitos adultos F1 de cinco días de edad (hombres y hembras) de cada grupo de dieta a -20 oC durante 90 s.
   2. Debajo de un estereoscopio, agarre suavemente el tórax de cada mosquito con fórceps y colóquelos de lado ventral hacia arriba.
   3. Recoger ambas alas con un bisturí y colocarlas en un portaobjetos de microscopio limpio que contiene una gota seca de medio de montaje. Con la ayuda de una aguja de 20 G añadir medios de montaje adicionales a los bordes de la cubierta y bajar lentamente el cubreobjetos sobre las alas.
   4. Mida la longitud del ala(Figura 6)con un estereoscopio utilizando un micrómetro.

Los resultados descritos a continuación comparan el rendimiento de los mosquitos Anopheles hembraalimentados con la comida artificial rica formulada (r-liq_diet) y los mosquitos alimentados con la dieta líquida inicial (i-liq_diet) o una comida de sangre fresca. La dieta fue probada siguiendo el protocolo esquemático descrito en la Figura 7. El r-liq_diet aquí descrito forma parte de una patente (PCT/IB2019/052967).

Porcentaje de hembras completamente engordadas

El número de mosquitos hembra engordados alimentados con el r-liq_diet (89%) fue significativamente mayor que el número de hembras engordadas alimentadas de sangre (56%) (Figura 8).

Fecundidad y fertilidad

La fecundidad femenina y la fertilidad para el primer ciclo gonotrófico se utilizaron para evaluar la calidad nutricional de la i-liq_diet y r-liq_diet. Las hembras, alimentadas con sangre fresca de vertebrados, pusieron un promedio de 24 a 11 huevos, mientras que las hembras alimentadas con liq_diet puso un promedio de 25 x 5 huevos(Tabla 2). No se observó la puesta de huevos por las hembras alimentadas con la i-liq_diet.

Mortalidad F1

La aptitud de los mosquitos F1 se evaluó entre colonias alimentadas con sangre de vertebrados o la r-liq_diet. Se registraron larvas, pupas y mortalidad adulta. La variabilidad (error estándar de la media [SEM]) fue mayor en los mosquitos alimentados con sangre(Figura 9 y Tabla 2)en relación con los mosquitos alimentados con el r-liq_diet. La generación F1 de mosquitos alimentados con la sangre o la r-liq_diet tenía tasas de mortalidad y supervivencia comparables.

Esperanza de vida de F1

Se estima por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades que los mosquitos hembra adultos salvajes viven hasta por un mes, pero probablemente no sobreviven durante más de 1 a 2 semanas y que los machos viven durante aproximadamente una semana y se alimentan exclusivamente de néctar y otras fuentes de azúcar. Se observa que las diferencias en la ingesta de alimentos parentales pueden afectar la supervivencia de la progenie de mosquitos17. En nuestro experimento, las hembras adultas y los machos en la sangre (mujeres 24,5 x 6,8; hombres de 18,5 a 6,9) y r-liq_diet (hembra: 22,5 x 8,1; hombres: 11,9 x 6,9) los grupos tenían una media de vida media similar(Tabla 3)y las hembras mostraron un aumento de la vida útil en relación con los hombres.

Tamaño del cuerpo F1

La longitud del ala se utilizó como un indicador del tamaño del cuerpo adulto. En comparación con otras especies, los adultos de Anopheles son mosquitos de tamaño pequeño a mediano con una longitud de ala de entre 2,8 y 4,4 mm de longitud de ala18. El tamaño adulto del cuerpo de los mosquitos F1 Anopheles alimentaba el r-liq_diet estaba dentro del rango esperado y era similar a los mosquitos insectarios alimentados con sangre(Figura 10).

Análisis estadístico

Los datos presentados representan la media de al menos tres experimentos independientes (a menos que se indique lo contrario). Las barras de error representan el SEM. Cuando los datos siguieron a una distribución gaussiana, se compararon grupos independientes utilizando la prueba t del estudiante, de lo contrario se aplicó la prueba Mann-Whitney. Las diferencias entre los grupos alimentados por dieta artificial se analizaron utilizando la prueba exacta de Fisher y se consideraron significativas en P a 0,05.

Figura 1: Recolección de sangre de ratón CD1 por punción intracardiaca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Aparato de alimentación artificial estándar. El alimentador de vidrio contiene r-liq_diet que se está alimentando a los mosquitos hembra anopheles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Mosquitos Anopheles después de la alimentación artificial. De izquierda a derecha: una hembra completamente engordada a la que se le ofreció r-liq_diet, hembra no engordada a la que se le ofreció r-liq_diet, macho, y completamente engordada hembra que se le ofreció sangre de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Los huevos de Anopheles pusieron 48 h después de la alimentación de las hembras con la r-liq_diet. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Etapas de larvas L2 que se desarrollaron a partir de los huevos y se recogieron en papel de filtro y se colocaron en bandejas que contienen agua destilada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Ala derecha de una generación F1 de un mosquito hembra Anopheles coluzzii. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Protocolo esquemático de pruebas de dieta artificial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Tasas de alimentación de los mosquitos hembra alimentados ya sea las dietas artificiales o la sangre. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los mosquitos alimentados con las dietas r-líquida e i-líquida y el grupo de control alimentado con sangre. Prueba exacta de Fisher de dos lados: ****P a 0,0001 (riesgo relativo: 0,4828, 95% nivel de confianza [CL]: 0,3776 a 0,6194) para la dieta r líquida frente a la sangre, *P a 0,0335 (riesgo relativo: 1,379, 95% CL: 1.044 a 1.836) para la sangre isus-líquido. Azul: sin alimentar; rojo: alimentado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Efecto de la comida sangrienta formulada en la mortalidad y la proporción hombre/mujer de los mosquitos Coluzzii F1 Anopheles. Se realizaron tres experimentos independientes, cada uno con 30 mosquitos por dieta. Una prueba t no emparejada no mostró diferencias significativas entre el grupo alimentado con sangre y el grupo alimentado con liq_diet r (los valoresP variaron de 0.5047 a 0.8491). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Longitud del ala. La distancia desde la incisión axial hasta la vena R4+5 excluyendo la seta de flecos se utilizó para determinar la longitud del ala. El tamaño se evaluó para 5 hembras y 5 machos de cada grupo dietético (media de SEM). Los valores se representan como la media de sem liq_diet. rojo: sangre vertebrada. Prueba t no emparejada; ala izquierda femenina: t a 1.300, df a 8, P a 0,2298; Ala izquierda macho: t a 2.400, df a 8, P a 0,0432; ala derecha femenina: t a 1.300, df a 8, P a 0,2298; ala derecha macho: t a 2.277, df a 7, P a 0,0569. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: La composición de la dieta i-líquida y la dieta r-líquida.

Tabla 2: Lotes de huevos producidos por hembras Anopheles coluzzii. Se realizaron tres experimentos independientes para cada dieta experimental utilizando 30 mosquitos hembra en cada uno.

Tabla 3: Esperanza de vida de los mosquitos F1 Anopheles. La longevidad de los mosquitos F1 de F0 alimentados artificialmente se evaluó registrando las fechas de nacimiento y muerte de cada mosquito provenientes del mismo grupo dietético (15 hembras y 15 machos fueron seguidos). Los resultados se representan como la vida media del mosquito por grupo de dieta.

Los autores no tienen nada que revelar.