Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

Resumen

Aquí, describimos un método de microaspiración de una sola célula para la separación de las amebas infectadas. Con el fin de separar subpoblaciones virales en Vermamoeba vermiformis infectados por Faustovirus y virus gigantes desconocidos, desarrollamos el protocolo detallado a continuación y demostramos su capacidad para separar dos nuevos virus gigantes de baja abundancia.

Resumen

Durante el proceso de cocultura de la ameba, más de un virus puede aislarse en un solo pozo. Hemos resuelto previamente este problema por dilución de punto final y/o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) aplicada a la población viral. Sin embargo, cuando los virus de la mezcla tienen propiedades morfológicas similares y uno de los virus se multiplica lentamente, se descubre la presencia de dos virus en la etapa de montaje del genoma y los virus no se pueden separar para una caracterización posterior. Para resolver este problema, desarrollamos un procedimiento de microaspiración de una sola célula que permite la separación y clonación de virus altamente similares. En el presente trabajo, presentamos cómo esta estrategia alternativa nos permitió separar las pequeñas subpoblaciones virales de Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7, virus gigantes que crecen lentamente y no conducen a la lisis amebal en comparación con el lítico y el crecimiento rápido Faustovirus. El control de pureza se evaluó mediante amplificación genética específica y se produjeron virus para su posterior caracterización.

Introducción

Los virus nucleocitoplasmáticos de ADN grande (NCLDV) son extremadamente diversos, definidos por cuatro familias que infectan los eucariotas^1. Los primeros virus descritos con genomas superiores a 300 kbps fueron Phydcodnaviridae, incluido el virus de la Clorella de paramecículo bursario 1 PBCV1². El aislamiento y la primera descripción de Mimivirus, mostraron que el tamaño de los virus se duplicó tanto en tamaño de la partícula (450 nm) como en la longitud del genoma (1,2 Mb)³. Desde entonces, se han descrito muchos virus gigantes, generalmente aislados mediante un procedimiento de cocultura de ameba. Varios virus gigantes con diferentes morfologías y contenidos genéticos pueden ser aislados de células sp. de Acanthamoeba, incluyendo Marsellavirus, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, y recientemente Medusavirus^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17}. Paralelamente, el aislamiento de Vermamoeba vermiformis permitió el aislamiento y la descripción de los virus gigantes Faustovirus, Kaumoebavirus y Orfeovirus^18,19,20. Otros virus gigantes fueron aislados con sus protistas huéspedes, como Cafeteria roenbergensis²¹, Aureococcus anophagefferens²², Chrysochromulina ericina 23 y Bodo saltans 22 , Chrysochromulina ericina²³y Bodo saltans ²⁴. Todos estos aislamientos fueron el resultado de un número cada vez mayor de equipos que trabajan en el aislamiento y la introducción de actualizaciones de estrategia de alto rendimiento^25,26,27,28, como el mejora del sistema de cocultura con el uso de citometría de flujo.

En 2016, utilizamos una estrategia que asocia baña cocultivo y citometría de flujo para aislar virus gigantes^27. Esta estrategia fue desarrollada para aumentar el número de muestras inoculadas, para diversificar protistas utilizados como soportes celulares, y para detectar rápidamente la lisis del soporte celular. El sistema se actualizó añadiendo un paso suplementario para evitar la identificación preliminar de la biología molecular y la detección rápida de una población viral desconocida como en el caso de Pacmanvirus²⁹. La citometría de flujo de acoplamiento a la clasificación celular permitió la separación de una mezcla de Mimivirus y Cedratvirus A11³⁰. Sin embargo, más tarde encontramos las limitaciones de la separación y detección de estas subpoblaciones virales por citometría de flujo. Después de la secuenciación, cuando ensamblamos los genomas de Faustovirus ST1²⁵ y Faustovirus LCD7 (datos no publicados), sorprendentemente encontramos en cada conjunto dos genomas suplementarios de dos virus novedosos no identificados en bases de datos públicas del genoma. Sin embargo, ni la citometría de flujo ni la microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostraron que las amebas estaban infectadas por dos virus diferentes, Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7. Diseñamos sistemas de PCR específicos para amplificar los marcadores Defaustovirus, Usurpativirus y Clandestinovirus, respectivamente, en función de sus genomas; nuestro propósito era tener sistemas basados en PCR que permitieran verificar la pureza de los virus separados. Sin embargo, la dilución de punto final y la citometría de flujo no pudieron separarlos. El aislamiento de esta única población viral fue difícil porque no se han caracterizado ni la morfología ni los elementos replicativos de las poblaciones de Clandestinovirus y Usurpativirus. Detectamos sólo una población viral por citometría de flujo debido a la superposición de las dos poblaciones (probada después de la separación efectiva). Tratamos de separarlos usando una sola partícula de clasificación en placas de 96 pocillos, pero no observamos ningún efecto citopático, y no detectamos Clandestinovirus ni Usurpativirus por amplificación de PCR. Por último, fue sólo la combinación de dilución de punto final seguida de una sola microaspiración de amebas lo que permitió la separación de estos dos virus gigantes de baja abundancia de Faustovirus. Este método de separación es el objeto de este artículo.

Protocolo

1. Cultura de amebas

1. Utilice Vermamoeba vermiformis (strain CDC19) como soporte celular.
2. Añadir 30 ml de proteasa-peptona-levadura extracto-glucosa medio (PYG) (Tabla 1) y 3 ml de la ameba ebae a una concentración de 1 x 10⁶ células/ml en un matraz de cultivo celular de 75 cm^2.
3. Mantener la cultura a 28oC.
4. Después de 48 h, cuantifique las amebas usando diapositivas de conteo.
5. Para enjuagar, cosechar las células a una concentración de 1 x 10⁶ células/ml y peletizar la amebae por centrifugación a 720 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en el volumen apropiado de medio de hambre para obtener 1 x 10⁶ células/ml(Tabla 1).

2. Propagación del virus de las poblaciones en Amebae

NOTA: Antes de la dilución, es importante cultivar la muestra de stock para obtener suficiente cultivo fresco, luego proceder a la filtración.

1. Utilice 1 x 10⁶ de cultivo de ameba en el medio de inanición.
2. Inocular la mezcla de virus emitidos a partir de la solución en stock (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 o Faustovirus/Clandestinovirus ST1) después del proceso de cocultivo en el soporte celular a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01.
   NOTA: El MINISTERIO de Tarifas es importante para reducir la abundancia de la población viral principal y el número de células infectadas.
3. Incubar a 30oC hasta que se induzquen efectos citopáticos (CPE), como redondeo amoebal o lisis, aproximadamente de 10 a 14 h después de la infección.
4. Recoger el medio y filtrar a través de un filtro de 5 m para eliminar los desechos celulares.

3. Dilución de punto final

1. Realizar una dilución en serie (10^-1 a 10^-11) de la muestra viral en el medio de inanición (Tabla 1).
2. Inocular 2 ml de 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis contenida en cada plato de Petri con 100 ml de la mezcla de inóculo.
3. Colocar los platos de Petri en una bolsa de plástico sellable a 30 oC.
4. Comience a observar los platos de Petri con microscopía óptica invertida a 6 h de postinfección y compruebe la morfología celular cada 4 a 8 h.
5. En la aparición del efecto citopático caracterizado por células de redondeo, comenzar el proceso de microaspiración de células únicas.

4. Microaspiración de células únicas

1. Prepare al anfitrión.
   NOTA: Esta preparación está hecha para la liberación de células individuales infectadas a un soporte celular nuevo.
   1. Tratar las amebas en el cultivo con un agente antimicrobiano que contenga 10 g/ml de vancomicina, 10 g/ml de imipenem, 20 g/ml de ciprofloxacino, 20 g/ml de doxiciclina y 20 g/ml de voriconazol. Esta mezcla se utiliza para evitar la contaminación bacteriana y fúngica.
      NOTA: El procedimiento tiene lugar en un banco fuera de la estación de seguridad microbiológica. Añadir 2 ml de amebas concentradas a 1 x 10⁶ células/ml cada una en 15 platos de Petri. Para la adherencia a la ameba, incubar el cultivo a 30 oC durante 30 min.
2. Seleccione la placa Petri utilizada para la microaspiración a partir de la dilución límite de acuerdo con los siguientes criterios: 1) ausencia de contaminación visible por agentes fúngicos y bacterianos, 2) evidencia de efecto citopático de amebas debido a los virus, y 3) pregolíforla y la fase de redondeo de las amebas (para evitar la aspiración de partículas virales).
3. Configure una estación de trabajo con los siguientes materiales (consulte la figura 1A,B):
   Micromanipulador, que permite el posicionamiento microcapilar;
   Dispositivo de presión de control manual, utilizado para aspirar y liberar las células en el microcapilar;
   Microscopio invertido;
   Módulos de motor Plug and Play;
   Cámara;
   Módulo informático para visualizar la manipulación y tomar fotografías.
4. Elija un microcapilar (véase el cuadro 1C).
   NOTA: El tamaño de las células, la deformación y adhesión de sus membranas a las superficies, y la motilidad celular pueden afectar el progreso suave de la micro-aspiración. El diámetro microcapilar se puede elegir y adaptar con precisión a tipos de células específicas en función de sus tamaños y métodos de aspiración. Se utilizó un microcapilar de 20 m de diámetro interior para aspirar una ameba de redondeo (diámetro de 10 m). Esto permite el mantenimiento de una posición interna y una fácil liberación de la célula.
5. Monte el sistema.
   1. Fije el ángulo de funcionamiento del sistema de agarre en el módulo motorizado a 45o.
   2. Realice una instalación doble, primero en el sistema de agarre, y luego en el microcapilar.
   3. Concéntrese en las células después de correr unas gotas de aceite a través del microcapilar.
      NOTA: El aceite mineral con compatibilidad biológica es suministrado por el dispositivo.
   4. Montaje completo siguiendo las recomendaciones del fabricante.
6. Clonar celdas (consulte la figura 2A, B).
   NOTA: Este procedimiento es similar al descrito por Fr-hlich y K-nig³¹.
   1. Coloque el plato Petri que contiene 2 ml de amebas infectadas bajo el microscopio.
   2. Concéntrese primero en las células y luego en el microcapilar inmerso en el cultivo.
   3. Escoge una sola célula redondeada y acerca el microcapilar al micromanipulador.
   4. Ejercer una aspiración suave con control de presión manual en la célula, llevándola dentro del microcapilar. Retire la célula única de la primera muestra y suéltela en el soporte celular, luego incubarla a 30 oC.
   5. Realizar observaciones diarias con un microscopio óptico invertido para observar la apariencia de las células y monitorear la aparición del efecto citopático.

5. Detección de PCR

NOTA: Después del paso 4, un cribado sistemático por PCR es crucial para confirmar la separación. Tanto en Usurpativirus/Faustovirus como en Clandestinovirus/Faustovirus, el diseño y la aplicación de los sistemas específicos de imprimación y sonda se realizaron utilizando Primer-BLAST en línea³² (Tabla 2).

1. Extraer ADN de una parte de las muestras de cultivo positivo (es decir, donde se observa un efecto citopático), utilizando un sistema de extracción automatizado de acuerdo con el protocolo del fabricante.
2. Utilice imprimaciones adecuadamente diseñadas.
   NOTA: Aquí diseñamos imprimaciones para amplificar los genes centrales anotados como RpB2 (Faustovirus), proteína cápside principal LCD7 (Usurpatvirus) y proteína cápside menor (Clandestinovirus)
3. Realice pcR estándar utilizando un termociclador.
   1. Llevar a cabo reacciones de PCR de 20 ml con 50 m de cadaimprimación (Tabla 2),1x mezcla maestra y agua libre de RNase.
   2. Activar la polimerasa de ADN Taq durante 5 min a 95 oC, luego seguir con 45 ciclos de desnaturalización de 10 s a 95 oC, recocido de las imprimaciones durante 30 s a 58 oC, y extensión para 30 s a 72 oC.
4. Ejecuta los productos PCR en un gel de agarosa del 1,5%, mancha con mancha de gel de ADN(Tabla de Materiales)y visualiza con UV.

6. Producción y purificación de virus

1. Vuelva a colocar el resto del cultivo de platos Petri en un pequeño matraz.
2. Para la producción de virus, preparar 15 matraces de 145 cm², que contengan 40 ml de Vermamoeba vermiformis en medio de inanición y 5 ml del virus aislado ya transferido de la placa Petri a frascos pequeños.
3. Tratar con el mismo antibiótico y mezcla antifúngica utilizado en el paso 4.1.
4. Incubar a 30oC. Observe todos los días con microscopía óptica invertida.
5. Después de la infección completa, piscina todos los matraces. Utilice un filtro de 0,45 m para eliminar los residuos.
6. Ultracentrifuge todos los sobrenatantes a 50.000 x g durante 45 min.
7. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante de cada tubo por aspiración y resuspenda el pellet en 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS).
8. Purificar el virus producido con 25% sacarosa (27,5 g de sacarosa en 100 ml de PBS, esterilizada por filtración).
9. Centrífuga 8 ml de sacarosa y 2 ml de la suspensión viral a 80.000 x g durante 30 min. Resuspender el pellet viral en 1 ml de PBS. Almacenar a -80 oC.

7. Microscopía electrónica de tinción y transmisión negativa

NOTA: Bou Khalil et al. publicaron previamente este protocolo²⁷.

1. Deposite 5 sl del sobrenadante de lisis en la rejilla de descarga de resplandor. Dejar actuar durante aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: La descarga de brillo nos permite obtener una rejilla hidrófila por aplicación de plasma.
2. Seque la rejilla cuidadosamente y deposite una pequeña gota de 1% de molibdato de amonio en ella durante 10 s. Deje que la rejilla se seque durante 5 min.
3. Proceda a observaciones de microscopía electrónica a 200 keV.

8. Caracterización del Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7

1. Caracterizar las poblaciones puras de Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7 utilizando la secuenciación del genoma, el montaje del genoma, los análisis bioinformáticos y el estudio de su ciclo replicativo como lo hemos hecho para otros virus^{10,20, 29}.

Resultados

La microaspiración de una sola célula es un proceso de micromanipulación optimizado en este manuscrito(Figura 1). Esta técnica permite la captura de una ameba redondeada e infectada(Figura 2A)y su liberación en una placa novedosa que contiene amebas no infectadas(Figura 2). Es un prototipo funcional que se aplica al sistema de cocultura y ha aislado con éxito virus gigantes no líticos. Este enfoque se utilizó por pr...

Discusión

La duración del manejo de la microaspiración de una sola célula y su buen funcionamiento depende del operador. Los diferentes pasos del experimento requieren precisión. El uso de los componentes de micromanipulación de la estación de trabajo debe estar bajo control constante observando el proceso de microaspiración y la liberación de la célula. El seguimiento por observación microscópica es necesario para la captura y transferencia de una célula. Un operador experimentado puede tomar de 1 a 2 h para aislar 10 células y v...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agarosa Estándar	Euromedex	Unkown	PCR estándar
AmpliTaq Gold 360 Master Mix Applied	Biosystems	4398876	PCR estándar
CellTram 4r Aceite	Eppendorf	5196000030	Control de las células durante el proceso de microaspiración
Matraces de cultivo celular Corning 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Cultivo
Matraces de cultivo celular Corning 25 cm2	Sigma-aldrich		CLS430639 Cultivo
Matraces de cultivo celular Corning 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Culture
Cámara DFC 425C	LEICA	Unkown	Observación/Monitoreo
Microscopio invertido Eclipse TE2000-S	Nikon	Unkown	Observación/Monitoreo
EZ1 advanced XL	Quiagen	9001874	extracción de ADN
Glasstic Slide 10 con rejillas de recuento	Kova International	87144E	Recuento de células
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	Standard PCR
Microcapilar 20 &; m	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiración y liberación de células
Micromanipulador InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Posicionamiento microcapilar
Agua sin nucleasas	ThermoFischer	AM9920	PCR estándar
Optima XPN Ultracentrífuga	BECKMAN COULTER	A94469	Purificación de virus
Placa de Petri 35 mm	Ibidi	81158	Cultivo/observación
Filtros de jeringa estériles 5 µ m	Sigma-aldrich	SLSV025LS	Filtración
SYBR verde Tipo I	Invitrogen	desconocido	Sondas moleculares fluorescentes/citometría de flujo
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	PCR estándar; Tinción de gel de ADN
Tecnai G20	FEI	Unkown	Microscopía electrónica
Tipo 70 Ti Rotor de titanio de ángulo fijo	BECKMAN COULTER	337922	Purificación
de virus Tubo ultratransparente, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Purificación de virus