Artículo de método

Un modelo de expresión de chemocina ectópico para probar el reclutamiento de macrófagos in Vivo

DOI:

10.3791/60161

⸱

25 de septiembre de 2019

 ,  , 
1Department of Developmental Biology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2Division of Cell, Developmental and Integrative Biology, School of Medicine, South China University of Technology

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para probar el efecto de una quimiocina en el reclutamiento in vivo de macrófagos, se utilizó toda la hibridación in situ del monte para detectar la expresión ectópica de la quimiocina, y se utilizó inmunomanchado para etiquetar los macrófagos. Las imágenes en vivo se utilizaron para la observación en tiempo real de la migración de macrófagos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los peces cebra son ampliamente utilizados en la investigación básica y biomédica. Muchas líneas transgénicas de pez cebra están actualmente disponibles para etiquetar varios tipos de células. Debido al cuerpo embrionario transparente del pez cebra, es conveniente para nosotros estudiar el efecto de una quimiocina en el comportamiento de un cierto tipo de células in vivo. Aquí proporcionamos un flujo de trabajo para investigar la función de una quimiocina en la migración de macrófagos in vivo. Construimos un plásmido de sobreexpresión específico del tejido para sobreexpresar IL-34 e inyectamos el plásmido en embriones de peces transgénicos de una célula cuyos macrófagos fueron etiquetados específicamente por una proteína fluorescente. A continuación, utilizamos hibridación fluorescente in situ de montaje completo e inmunomancha para detectar el patrón de la expresión de quimiocina y el número o ubicación de los macrófagos. Los embriones WT inyectados fueron levantados para generar una línea transgénica estable. Finalmente, utilizamos imágenes en vivo confocales para observar directamente el comportamiento de los macrófagos en los peces transgénicos estables para estudiar la función de IL-34 en los macrófagos in vivo.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish es un pequeño pez tropical de agua dulce de huesos duros originario de la India. En cuanto a la conservación del gen, el pez cebra tiene una similitud del 87% con el humano1. Puede proporcionarnos información sobre temas relacionados con el ser humano mediante el estudio de la regulación genética, la función proteica y el comportamiento celular, como la migración, la proliferación et.al en el pez cebra. El embrión zebrafish se puede utilizar para observar el desarrollo de embriones tempranos en diferentes etapas después de inhibir el pigmento. Mientras tanto, el pez cebra tarda sólo tres meses en convertirse en madurez sexual, entonces el pez cebra puede producir cientos de huevos cada 4 días. Mini-tamaño, simple cría, fuerte capacidad reproductiva, estas ventajas hacen que el cultivo de peces cebra muy ahorro de espacio, propicio para el cultivo a gran escala. El ratón modelo de mamífero tradicional tiene costos de mantenimiento más altos que el pez cebra, lo que limita la escala de la elevación del ratón. En el aspecto del desarrollo temprano del embrión, el embrión de ratón es difícil de observar en estado vivo debido a las características del desarrollo del embrión de ratón en el útero materno. Por el contrario, los embriones de pez cebra se desarrollan externamente y son transparentes, por lo que son fáciles de observar bajo un microscopio. Además, el pez cebra es muy fácil de construir una variedad de líneas transgénicas para la investigación de la función génica relacionada. Actualmente, varias líneas transgénicas de pez cebra están disponibles para etiquetar diferentes tipos de células. Es muy conveniente ahora construir líneas transgénicas para sobreexpresar quimiolinas en lugares específicos y estudiar la función de las quimiolinas en el comportamiento celular en el pez cebra.

Aquí, proporcionamos un flujo de trabajo para utilizar la línea transgénica de pez cebra para investigar la función de IL-34 sobre el comportamiento de los macrófagos in vivo2,3,4,5,6,7. En primer lugar, construimos un plásmido de sobreexpresión específico del hígado del gen il34 e inyectamos el plásmido en embriones de peces Tg (mpeg1: GFP) de una célula que etiquetaron específicamente los macrófagos por proteína fluorescente GFP. Luego, utilizamos hibridación fluorescente in situ de montaje completo e inmunomancha para detectar el patrón de la expresión il34 y el número o ubicación de los macrófagos. Los embriones WT inyectados fueron levantados para generar una línea transgénica estable. En estos pasos, establecimos y validamos la línea productora de citoquinas y evaluamos visualmente los efectos que se pueden ver en la distribución de los macrófagos. Por último, para investigar el comportamiento de los macrófagos en respuesta a la citoquina, utilizamos imágenes en vivo confocales para observar directamente la migración de macrófagos para confirmar la función de il34 en la migración de macrófagos in vivo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Todas las muestras fueron tratadas con agua de huevo de feniltiourea (PTU) para inhibir el pigmento.

1. Generación de Tg (fabp10a:il34) Construcciones transgénicas e inyección de pescado

  1. Clonar el promotor fabp10a 8 de 2,8 kb y las regiones de codificación IL-34 (ENSDART00000126460.3) del pez cebra en el vector pTol2 para generar la construcción fabp10a-il34. Inyectar las construcciones en la etapa de una célula Tg (mpeg1: GFP) y WT embriones de peces junto con el ARNm transposasa. Elevar los embriones WT inyectados en fabp10a-il34 aadultos 9 e identificar al fundador transgénico mediante la hibridación in situ.
    NOTA: La inyección de la construcción Tol2 directamente en otro transgénico podría ser problemática si la otra línea transgénica se hace con el mismo sistema de transposon. Una práctica general sería hacer una línea transgénica independiente y posteriormente cruzar la nueva línea con otra línea de reportero. Esto garantiza que no habrá efectos de la nueva transgénesis en un transgén insertado previamente.

2. Montaje entero fluorescente in Situ Hybridization (WISH) Combinar con inmunostaining

  1. Fijación de muestras
    1. Recoger embriones de inyección transitoria o línea transgénica IL-34 estable que se cruzó con Tg (mpeg1: GFP) en las etapas deseadas.
      NOTA: Para este caso, los embriones fueron recogidos a 4 d después de la fertilización (dpf). (Si es necesario) retire el coro con jeringa.
    2. Fijar los embriones con 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche a 4 oC o 2 h a temperatura ambiente (RT) (alrededor de 25 oC).
    3. Lavar los embriones con solución salina tamponada de fosfato más Tween 20 (PBST) 3x 5 min.
    4. Deshidratar los embriones por separado con 50% de metanol en PBST (50% metanol/PBST) y 100% metanol, 1x 5 min cada uno. A continuación, cambiar a metanol fresco 100% y almacenar a -20 oC (al menos 2 h).
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
  2. Hibridación de sondas (Día I)
    1. Rehidratar los embriones en los pasos anteriores con 50% de metanol en PBST (50% Metanol/PBST), luego lavar con PBST 3x 5 min.
    2. Digerir los embriones con proteinasa K en PBST a RT (concentración final: 10 g/ml; 1:2000 en PBST).
      NOTA: El tiempo de digestión depende de la etapa de los embriones: Menos de 36 h después de la fertilización (hpf), sin necesidad; 36 hpf-2 dpf embrión, 3-5 min; 2-3 dpf embrión, 10 min; 3-4 dpf embrión, 15 min; 4-5 dpf embrión, 15-20 min; 5-6 dpf embrión, 20-27 min; >6 dpf embrión, 25-30 min a RT (alrededor de 25oC).
    3. Deseche la solución de digestión y vuelva a realizar la fijación con 4% de PFA, durante 20 min a RT.
    4. Lavar los embriones con PBST 2x 10 min.
    5. Deseche el PBST, realice la prehibridación con búfer de hibridación calentado (buffer HB) a 65 oC durante 5 min, recicle el búfer HB en el tubo original.
    6. Realizar la pre-hibridación con el nuevo búfer HB calentado a 65 oC al menos 1 h.
    7. Precalentar la sonda9 (para este caso era una sonda il34, 1 ng/mL) a 65 oC al menos 10 min. A continuación, recicle el búfer HB en el tubo original. Realice la hibridación con la sonda precalentada a 65 oC durante la noche.
  3. Tratamiento de anticuerpos (Día II)
    1. Precalienta el 50% de formamida/2x citrato de sodio salino más Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0.2x SSCT a 65oC.
    2. Recicle la sonda en el tubo original y almacene la sonda a -20 oC.
    3. Lavar los embriones por separado con 50% de formamida/2x SSCT; 2x SSCT; 0,2x SSCT, 3x 20 min o 2x 30 min cada uno a 65oC.
    4. Lavar los embriones con PBST 3x 5 min.
    5. Bloquear las muestras con 600 l de tampón de bloqueo (5% de suero bovino fetal filtrado (FBS) en PBST) durante 1 h a RT.
    6. Añadir 400 l de solución de anticuerpos antidigoxigenina-HRP (1:1.000-1:2.000 en tampón de bloqueo) e incubar los embriones a 4 oC durante la noche. Si las señales son débiles, utilice 1:500 dilución de anticuerpos.
  4. Incubación de anticuerpos primarios y colorantes (Día III)
    1. Retire el anticuerpo; lavar los embriones con PBST, 6x 20 min a RT.
    2. Enjuague la muestra con 30 s l de diluyente de amplificación 1x Plus durante 5 min a RT.
    3. Deseche el diluyente pipeteando; Diluir fluorofore Tyramid stock Solution (Cyanine 3 Plus Amplification Reagent (Cy3) o Cyanine 5 Plus Amplification Reagent (Cy5), para este caso se utilizó Cy3) 1:50 en 1x Plus Amplification Diluent para hacer la solución de trabajo de tiramida de fluoróforo. Prepare 50-100 l de solución de trabajo para cada muestra.
    4. Incubar la muestra en la solución de trabajo de tiramida de fluoróforo durante 5-15 minutos en la oscuridad a RT. Si las señales son débiles, amplíe el tiempo de incubación a 30 min.
    5. Detenga la reacción cambiando la solución de trabajo con PBST y examine las señales.
    6. Lavar los embriones con PBST 3x 10 min a RT.
    7. Incubar la muestra con anticuerpoprimario a 4oC durante la noche. Para este caso, utilice el anticuerpo Goat-Anti-GFP como anticuerpo primario.
  5. Tinción secundaria de anticuerpos (Día IV)
    1. Lavar los embriones con PBST durante 4x 30 min.
    2. Incubar los embriones con anticuerposecundario a 4oC durante la noche. Para este caso, utilice el anticuerpo Alexa 488-Anti-Goat como anticuerpo secundario.
  6. Tomar fotos (Día V)
    1. Lavar los embriones con PBST 3x 10 min a RT.
    2. Almacenar los embriones en 70% glicerol en la oscuridad a 4 oC durante la noche o -20 oC durante más tiempo.

3. Imágenes en vivo

  1. Selección de muestras
    NOTA:     Utilice la imagen en vivo para observar directamente si los macrófagos de Tg (fabp10a: il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP) peces migrarían al hígado bajo IL-34 inducción durante 3-3.5 dpf. Aquí la línea transgénica Tg (fabp10a-DsRed) se utiliza para etiquetar la región hepática y hacerla visible, para facilitar la localización del hígado y para determinar si los macrófagos migran al hígado. Antes de tomar imágenes, utilice un microscopio de fluorescencia para seleccionar los embriones dobles positivos DsRed y GFP.
  2. Montaje de peces
    1. Utilice un baño de metal para calentar 1 ml de agarosa de fusión baja al 1% a más de 90 oC para derretirla por completo.
    2. Después de que la baja agarosa de fusión se enfríe a la temperatura corporal, agregue 50 ml de tricaína al 0,2% y mezcle uniformemente la tricaína con la agarosa.
    3. Mover los embriones anestesiados a un pequeño plato montado con un tobogán de cubierta en la parte inferior, quitar el agua circundante, soltar lentamente la baja agarosa de fusión en los embriones, establecer cuidadosamente la posición del pez antes de que la agarosa se solidifica, mantener el área del hígado cerca de la cubierta se desliza en la parte inferior del plato.
    4. Después de que la baja agarosa de fusión se solidifica, cúbrala cuidadosamente con otra capa de agarosa para reforzarla.
    5. Coloque el plato en la mesa portadora del microscopio confocal, cubra el pescado con la solución E210 con tricaína y comience la toma de imágenes.
  3. Funcionamiento del software del microscopio confocal
    1. Abra el software ZEN black 2.3, instale el banco de trabajo de células vivas en la mesa portadora del microscopio.
    2. Haga clic en Localizar (Localizar) Incubación ? Temperatura para ajustar la temperatura a 29oC.
    3. Coloque el plato en el centro de la mesa de trabajo de la célula viva, cubra el pescado con la solución E210 con tricaína.
    4. Haga clic en el menú Adquisición, seleccione el modo de escaneado y los láseres necesarios en el menú Configuración inteligente y, a continuación, seleccione Z-Stack y Posición.
    5. Haga clic en el menú Diseñador de experimentos, seleccione Habilitar experimentode bloque múltiple , en el primer bloque, para encontrar la muestra bajo la ampliación baja y, a continuación, cambie a la ampliación alta y, a continuación, deje que el área observada en el centro del campo visual.
    6. Establezca la posición y la información de Z-Stack, seleccione la intensidad láser adecuada, las capas de escaneo y la velocidad de imagen.
    7. Cree un nuevo bloque y repita los pasos anteriores. Después de configurar todos los bloques, establezca el número adecuado de bucles y comience a grabar(Figura 1).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los pasos involucrados en el protocolo de pez cebra se ilustran en la Figura 2. En primer lugar, generamos la construcción pBLK-fabp10a-il34-sv40 en la que il34 fue impulsado por el promotor fabp10a (Figura 2). La construcción fue microinyectada en la etapa unicelular Tg (mpeg1: GFP) embriones de pez cebra que pueden etiquetar macrófagos con embriones GFP y WT que fueron elevados a adultos para...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito aquí nos permite investigar la función de una quimiocina sobre el comportamiento de los macrofagoin vivo y el procedimiento requiere cierta experiencia técnica. En resumen, hay varios pasos críticos para evitar complicaciones en el protocolo: 1) seleccionar una línea transgénica adecuada que muestre una señal transgénica específica y fuerte para etiquetar la célula de interés; 2) seleccionar un tejido apropiado al que se pueda acceder a imágenes y sobreexpresión de genes transgénicos; 3) hacer una s...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. Jingrong Peng por compartir la línea transgénica Tg (fabp10a: DsRed); Dr. Zilong Wen por compartir las líneas transgénicas Tg (mpeg1: GFP); Dr. Koichi Kawakami por proporcionar el vector pTol2. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31771594), los proyectos del Plan de Ciencia y Tecnología de Guangdong (2019A030317001) y los Fondos Fundamentales de Investigación para las Universidades Centrales (D2191450).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
fuerte
Alexa 488-Anticuerpo anti-cabraInvitrogenA11055
Anti-Digoxigenina-HRP perkinelmerNEF832001EA
anticuerpo anti-GFPde cabra Abcamab6658
fuerte< / fuerte>
CaCl2< / sub>· 2H2< / sub>OSigma21097
Cianina 3 Plus Reactivo de amplificaciónperkinelmerNEL745001KT
E2 solución15 mM  NaCl +0,5 mM KCl +1,0 mM MgSO4+150 µ M  KH2PO4 + 50 y micro; M  Na2HPO4 +1,0 mM CaCl2 + 0,7 mM NaHCO3 
Suero Fetal Bovino (FBS)Life10099-133
FormamidaDiamanteA100314
Glicerol SigmaV900860
Heparina sódicaSigmaH3149
Tampón de hibridación (HB)50% formamida + 5 veces; SSC+9 mM citrato de sodio+50 μ g/ml heparina sódica+ 500 μ g/mL ARNt+ 0.1% Tween20
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Agarosa de bajo punto de fusiónSigmaA9414
MetanolGHTECH1.17112.023
Azul de metileno SigmaM9140
MgSO4SigmaM2643
Na2HPO4SigmaS5136
NaClSigmaS5886
NaHCO3 SigmaS5761
Paraformaldehído (PFA)Sigma158127Suspender 16 g de PFA en 400 ml de 1x PBS, calentar a 60 & deg; C  para disolver unos 30 min. Esta solución se puede preparar con anticipación y almacenar a -4 °C. Precaución. Manipular con mascarilla.
10 veces; PBS14,2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2,4 g KH2PO4 en 1L ddH2O
Phenylthiourea (PTU)SigmaP7629
1× Diluyente de amplificación PlusperkinelmerNEL745001KT
proteinasa K FermentasE00492
20× Citrato de sodio salino (SSC)175,3 g NaCl+ 88,2 g de citrato de sodio en 1 L ddH2O, PH 7,0
Citrato de sodioSigmaA5040
TricaínaSigmaE10521
tRNA SigmaR6625
Tween20SigmaP2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40Para Tg (fab10a:il34) generación de líneas transgénicas
pBSK-il34Para il34 preparación de sondas
Fish
Tg (mpeg1: GFP)Etiquetar macrófagos con GFP
Tg (fabp10a: DsRed)Marcar células hepáticas con DsRed
Tg (fab10a:il34)Sobreexpresión de IL-34 en células hepáticas

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
  3. Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
  4. Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
  5. Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045(2013).
  6. Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
  7. Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
  8. Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
  9. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. Eugene, OR. (2000).
  10. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: a practical approach. , Oxford University Press. New York. (2002).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Modelo de pez cebrasobreexpresi n de IL 34hibridaci n in situ fluorescenteinmunotinci nimagen confocal en vivoembriones de peces transg nicosmacr fagos marcados con GFPpl smido espec fico de tejido

Artículos relacionados