Aquí, presentamos un protocolo para la recolección de espectros Raman confocales de sujetos humanos en estudios clínicos combinados con enfoques quimiométricos para la eliminación de valores atípicos espectrales y la posterior extracción de características clave.
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Artículo de método
Resolución de agua, proteínas y lípidos de In Vivo Confocal Raman Spectra de Stratum Corneum a través de un enfoque quimiométrico
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Resumen
Resumen
El desarrollo de este método espectroscópico Deraman confocal in vivo permite la medición directa de agua, proteínas y lípidos con resolución de profundidad en sujetos humanos. Esta información es muy importante para las enfermedades relacionadas con la piel y caracterizar el rendimiento del producto para el cuidado de la piel. Este protocolo ilustra un método para la recolección de espectros Raman confocales y el análisis posterior del conjunto de datos espectral aprovechando la quimiometría. El objetivo de este método es establecer un protocolo estándar para la recopilación de datos y proporcionar orientación general para el análisis de datos. El preprocesamiento (por ejemplo, la eliminación de espectros atípicos) es un paso crítico al procesar grandes conjuntos de datos de estudios clínicos. Como ejemplo, proporcionamos orientación basada en el conocimiento previo de un conjunto de datos para identificar los tipos de valores atípicos y desarrollar estrategias específicas para eliminarlos. Se realiza un análisis de componentes principales y los espectros de carga se comparan con los espectros de los materiales de referencia para seleccionar el número de componentes utilizados en el análisis final de la resolución de curva sorcada (MCR). Este enfoque es exitoso para extraer información significativa de un dataset espectral grande.
Introducción
En estudios clínicos, la espectroscopia in vivo confocal de Raman ha demostrado su capacidad única para determinar el espesor del estrato córneo y el contenido de agua1,2,3,4, y el seguimiento de la penetración de materiales activos aplicados tópicamente a la piel5,6. Como enfoque no invasivo, la espectroscopia confocal de Raman detecta señales moleculares basadas en modos vibratorios. Por lo tanto, el etiquetado no es necesario7. La espectroscopia In vivo confocal de Raman proporciona información química con resolución de profundidad basada en la naturaleza confocal de la técnica. Esta información dependiente de la profundidad es muy útil en el estudio de los efectos de los productos para el cuidado de la piel4,8, envejecimiento9,10, cambios estacionales3, así como enfermedades de la función de barrera de la piel, como la dermatitis atópica11,12. Hay mucha información en la región de alta frecuencia de espectroscopia raman confocal (2.500-4.000 cm-1), donde el agua produce picos distintos en la región entre 3.250-3.550 cm-1. Sin embargo, los picos Raman de proteínas y lípidos, que se centran entre aproximadamente 2.800-3.000 cm-1, se superponen entre sí porque las señales se producen principalmente a partir de metileno (-CH2-) y metil (-CH3) grupos13 . Esta información superpuesta presenta un desafío técnico al obtener cantidades relativas de especies moleculares individuales. Se han utilizado los enfoques de ajuste máximo14,15 y posición pico selectiva12,16 para resolver este desafío. Sin embargo, es difícil para estos métodos basados en picos únicos extraer información de componentes puros porque varios picos Raman del mismo componente cambian simultáneamente17. En nuestra reciente publicación18, se propuso un enfoque MCR para dilucidar la información de componentes puros. Con este enfoque, se extrajeron tres componentes (agua, proteínas y lípidos) de un conjunto de datos espectroscópico Raman confocal grande in vivo.
La ejecución de grandes estudios clínicos puede ser exigente en individuos que recopilan datos espectroscópicos in vivo. En algunos casos, la adquisición espectral puede requerir equipo operativo durante muchas horas al día y el estudio puede extenderse hasta semanas o meses. En estas condiciones, los operadores de equipos que carecen de la experiencia técnica para identificar, excluir y corregir para todas las fuentes de artefactos espectroscópicos pueden generar datos espectroscópicos. El conjunto de datos resultante puede contener una pequeña fracción de valores atípicos espectroscópicos que deben identificarse y excluirse de los datos antes del análisis. Este documento ilustra en detalle un proceso de análisis quimiométrico para "limpiar" un conjunto de datos clínico de Raman antes de analizar los datos con MCR. Para eliminar con éxito los valores atípicos, es necesario identificar los tipos de valores atípicos y la posible causa de la generación de los espectros atípicos. A continuación, se puede desarrollar un enfoque específico para eliminar los valores atípicos de destino. Esto requiere un conocimiento previo del conjunto de datos, incluida una comprensión detallada sobre el proceso de generación de datos y el diseño del estudio. En este conjunto de datos, la mayoría de los valores atípicos son espectros de señal a ruido bajos y se originan principalmente a partir de 1) espectros recogidos por encima de la superficie de la piel (6.208 de 30.862), y 2) una fuerte contribución al espectro de la luz fluorescente de la habitación (67 de 30.862). Los espectros recogidos por encima de la superficie de la piel producen una respuesta Raman débil, ya que el punto focal del láser se acerca a la superficie de la piel y se encuentra principalmente en la ventana del instrumento debajo de la piel. Los espectros con una fuerte contribución de la luz fluorescente de la sala se generan debido a un error del operador del instrumento o al movimiento del sujeto, lo que produce una condición en la que la ventana de colección confocal de Raman no está completamente cubierta por el sitio del cuerpo del sujeto. Aunque estos tipos de artefactos espectrales podían ser identificados y remediados durante la adquisición espectral por un experto espectroscópico en el momento de la adquisición de datos, los operadores de instrumentos capacitados utilizados en este estudio recibieron instrucciones para recopilar todos los datos a menos que se observó un fallo catastrófico. La tarea de identificar y excluir valores atípicos se incorpora al protocolo de análisis de datos. El protocolo presentado está desarrollado para resolver este desafío. Para abordar los espectros de señal a ruido bajos por encima de la superficie de la piel, la ubicación de la superficie de la piel debe determinarse primero para permitir la eliminación de los espectros recogidos por encima de la superficie de la piel. La ubicación de la superficie de la piel se define como la profundidad donde el punto focal láser Raman está la mitad en la piel y la mitad fuera de la piel como se ilustra en la Figura Suplementaria 1. Después de eliminar espectros bajos de señal a ruido, se implementa un análisis de componentes principales (PCA) para extraer el factor dominado por picos de luz fluorescente de la sala. Estos valores atípicos se eliminan en función del valor de puntuación del factor correspondiente.
Este protocolo proporciona información detallada sobre cómo se determinan seis componentes principales en el proceso MCR. Esto se hace a través de un análisis de PCA seguido de la comparación de la forma espectral entre las cargas de los modelos generados con un número diferente de componentes principales. También se explica en detalle el proceso experimental para la recopilación de datos de materiales de referencia, así como de los sujetos humanos.
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional del Beijing Children's Hospital en cumplimiento de las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975. Se llevó a cabo de acuerdo con las pautas ich para buenas prácticas clínicas. El estudio tuvo lugar de mayo a julio de 2015.
1. Colección de espectros de Raman confocalines in vivo de sujetos humanos con dermatitis atópica
- Incluir asignaturas de conformidad con los siguientes criterios.
- Incluya sujetos entre las edades de 4–18 años.
- Incluir sujetos con dermatitis atópica leve a moderada (puntuación de 2 o 3 según la evaluación global del médico) con síntomas activos de la enfermedad en 5%–30% de la superficie corporal, con al menos dos lesiones en los brazos.
- Incluya sujetos que estén en buen estado de salud, excluyendo los síntomas directamente relacionados con la enfermedad de AD.
- Incluir temas que proporcionen consentimiento informado por escrito.
- Incluya sujetos que tengan un valor de ángulo de topología individual (ITA) superior a 40 en la ubicación de prueba.
- Excluya los temas que cumplan cualquiera de los siguientes criterios.
- Excluir sujetos que estén participando actualmente o que hayan participado previamente en un estudio clínico en cualquier centro de pruebas dentro de las 4 semanas anteriores.
- Excluya a los sujetos con cáncer o que hayan sido diagnosticados o tratados para el cáncer dentro de los 5 años anteriores al estudio.
- Excluir sujetos diabéticos.
- Excluya a los sujetos que tengan una enfermedad inmunológica o infecciosa que pueda poner al sujeto en riesgo o interferir con la precisión de los resultados del estudio (es decir, hepatitis, tuberculosis, VIH, SIDA, lupus o artritis reumatoide).
- Excluya los sujetos que tengan afecciones de la piel que puedan interferir con las mediciones instrumentales o que impidan la evaluación clara de la piel solo a la dermatitis atópica. Algunos ejemplos son la piel extremadamente seca, la piel dañada, los cortes, los arañazos, las quemaduras solares, las marcas de nacimiento, los tatuajes, las cicatrices extensas, las erupciones cutáneas, el crecimiento excesivo del cabello o el acné.
- Excluya los sujetos que utilizan medicamentos inmunosupresores orales, antibióticos u otras terapias sistémicas en el último mes, excepto para tranquilizantes menores.
- Excluir sujetos con cualquier otra condición médica que, en opinión del investigador, les impida participar en el estudio.
- Excluya los sujetos con mayor pigmentación en el área de prueba.
- Etiquete el área de la lesión del participante del estudio de la dermatitis atópica y marque con un área de 3 cm x 4 cm en o cerca del sitio de la lesión como se muestra en la Figura 1A.
- Etiquetar el área de no lesión con el mismo marcador en el sitio del cuerpo homólogo (por ejemplo, antebrazo izquierdo frente a antebrazo derecho) como se muestra en la Figura 1B.
- Coloque el sitio del cuerpo marcado en estrecho contacto con la ventana del instrumento Raman confocal in vivo como se muestra en la Figura 2A y la Figura 2B. Cubra toda la ventana para evitar el impacto de la luz de la habitación en el sitio del cuerpo.
- Realice la recopilación de datos de Raman.
NOTA: El instrumento tiene una resolución espectral de 2 cm-1 y 50x objetivo de microscopía (NA - 0,9 inmersión en aceite), utilizando un láser de 671 nm con una potencia de 17 mW. La longitud de onda se calibra utilizando el espectro de una lámpara de neón-argón incorporada. La calibración de intensidad se realiza midiendo el espectro de un estándar de calibración de vidrio NIST (National Institute of Standards).- Mueva el enfoque hasta que se observe un espectro como se ilustra en la Figura 2C y, a continuación, aleje el foco de la superficie de la piel a 10 m.
- Inicie la recopilación de datos durante 26 pasos con un tamaño de paso de 2 m en la región de frecuencia de 2.510 cm-1–4.000 cm-1. Utilice un tiempo de exposición de 1 s y mida ocho réplicas para cada área que dure entre 10 y 15 minutos en total.
2. Colección de espectros Raman confocales a partir de materiales de referencia
- Colocar los materiales de referencia, los principales componentes en la piel humana estrato córneo19, en la ventana del instrumento Raman confocal (ver Tabla de Materiales: Albúmina Sérica Bovina (BSA), agua desionizada (agua DI), ceramida, colesterol, libre ácido graso, y el escualeno).
- Recoja los espectros Raman de los materiales de referencia consecutivamente desde el exterior del material hasta el centro de materiales utilizando los mismos parámetros de recogida descritos anteriormente.
- Integre el área bajo cada espectro de Raman entre el rango de 2.510-4.000 cm-1 e identifique los tres puntos de valor máximo principales en estas 26 mediciones. Promedio de los espectros Raman de esos tres puntos para obtener los espectros de material de referencia final.
3. Eliminación de los espectros atípicos mediante análisis quimiométricos
- Determinar la superficie de la piel y eliminar los espectros fuera de la piel.
- Cambie la extensión de archivo de '.ric' a '.mat' y cargue el archivo .mat en la plataforma de software MATLAB.
- Corrija la línea base con Línea base (Mínimos cuadrados ponderados automáticos) haciendo clic con el botón derecho en el dataset importado en Analizar . Otras herramientas ? Preprocesamiento en el software PLS_Toolbox con la configuración predeterminada.
- Sume los valores entre 2.910–2.965 cm-1 para obtener los valores de intensidad bajo cada espectro Raman a partir de la medición de 26 pasos consecutivos como se muestra en la Figura 3A a través de la función de suma en MATLAB.
- Interpolar el valor de desplazamiento del instrumento (valor en el eje X de la Figura 3B) de 26 a 260 utilizando la función linspace en MATLAB.
- Interpolar el valor de intensidad de 26 a 260 utilizando el método spline en MATLAB, aprovechando los valores de 260 posiciones recién generados.
- Utilice las funciones polyfit y polyval de MATLAB para obtener el nuevo conjunto de valores de intensidad con 260 puntos. En primer lugar, utilice los valores de posición e intensidad 260 como entradas X e Y para la función polyfit, respectivamente. Establezca el valor de grado en 20. A continuación, utilice los coeficientes de salida y los 260 valores de posición extendida como entrada para polyval para obtener los valores de intensidad finales de 260.
- Utilice las funciones max y min de MATLAB para identificar los puntos máximos y mínimos de los valores de intensidad 260 recién interpolados.
- Calcule el valor de intensidad media dividiendo la suma del valor de intensidad máximo y mínimo por dos.
- Identifique el valor de intensidad de los valores de intensidad 260 (calculados a partir del paso 3.1.6) más cercanos al valor de intensidad media y establezca su valor de posición correspondiente como superficie de la piel. Establezca este valor de posición como el punto cero en el eje X como se muestra en la Figura 3B.
- Cambie todos los demás valores de posición de acuerdo con el punto cero y el tamaño de paso conocido de 2 m.
- Retire todos los espectros recogidos por encima de la superficie de la piel de acuerdo con su valor de posición.
- Importe el resto de los datos a PLS_Toolbox para crear un conjunto de datos y cámbiele el nombre a "RamanData.mat".
- Retire los espectros atípicos con el efecto de luz de la habitación.
- Cargue el conjunto de datos de espectros de Raman (RamanData.mat) después de eliminar los espectros fuera de la piel e implemente el análisis de PCA.
- Cargue el conjunto de datos en el software PLS_Toolbox en la plataforma MATLAB y haga clic con el botón derecho del programa en el conjunto de datos para elegir Analizar . PCA.
- Seleccione Normalizar como enfoque de preprocesamiento y elija Ninguno para la validación cruzada.
- Utilice los tres componentes para el análisis de descomposición PCA tal y como se muestra en de la Figura Suplementaria 2.
- Retire la cubierta de la ventana de recogida del instrumento In vivo Raman y recoja los espectros de luz de la habitación en la región de alta frecuencia utilizando los mismos parámetros utilizados para la recopilación de datos de materiales de referencia.
- Identifique el factor de efecto de luz de la habitación mediante la comparación con los espectros de fondo de luz de la habitación, como se muestra en la Figura complementaria 3.
- Elimine los espectros con un valor de puntuación correspondiente significativamente mayor de lo normal (más del 99,8% de los valores de puntuación de todo el conjunto de datos, que es 0,16 en este estudio).
4. Selección del número de componentes en el análisis de descomposición de MCR
- Corrija la línea base del espectro Raman utilizando el mismo enfoque descrito anteriormente (sección 3.1.2).
- Realice el análisis de PCA en el conjunto de datos preprocesado como se describió anteriormente (sección 3.2) excepto para seleccionar "PQN" – "Centro medio" en lugar de "Normalizar", y trazar los valores propios en escala logarítmica junto con el número de componentes (20) como el número predeterminado en el análisis de descomposición haciendo clic en el botón Elegir componentes y seleccione log(eigenvalues) como el valor Y. Elija de tres a ocho como el número de componentes utilizados para el análisis MCR.
- Realice el análisis MCR.
- Cargue el conjunto de datos en el software MCR_main20 a través del botón Selección de datos.
- Seleccione el número de componentes (tres a ocho) haciendo clic en el botón Determinación del número de componentes.
- Haga clic en el botón Puro en la pestaña Estimación inicial, seleccione Concentración en la ficha Dirección de la selección de variables y haga clic en el botón Hacer.
- Haga clic en el botón Aceptar y, a continuación, en el botón Continuar a la página siguiente.
- Haga clic en Continuar en la página siguiente y, a continuación, seleccione fnnls y 6 en las pestañas Implementación y Nr. de especies con perfiles de no negatividad, respectivamente. Haga clic en el botón Continuar.
- Elija los mismos parámetros que la sección 4.3.5 para esta página y haga clic en Continuar.
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Resultados
En este estudio clínico, se recogieron espectros de Raman confocal in vivo de 28 sujetos de 4 a 18 años de edad. Un total de 30.862 espectros Raman fueron recogidos con el protocolo de recopilación de datos mencionado anteriormente. Este dataset espectral grande contiene 20% de valores atípicos espectrales como se muestra en la Figura 4A. Los espectros atípicos de señal a ruido bajos se eliminaron después de determinar la superficie de la piel, seguidos por el PCA para identificar los es...
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Discusión
Durante la recopilación de datos, como se describe en las secciones 2 y 3 del protocolo, cada perfil de profundidad se recopiló en un área con contacto entre la ventana del instrumento y la piel mediante la búsqueda de las áreas más oscuras de las imágenes microscópicas resaltadas en los círculos rojos en Figura 2C. Una vez localizadas estas áreas, fue fundamental iniciar el perfil de profundidad por encima de la superficie de la piel para determinar con precisión la ubicac...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen en gran medida el apoyo financiero del departamento de atención analítica y de limpieza personal de la función corporativa. Queremos expresar nuestra gratitud a los directores asociados analíticos, Sra. Jasmine Wang y Dr. Robb Gardner, por su orientación y apoyo y a la Sra. Li Yang por su ayuda en la recopilación de datos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albúmina sérica bovina | Colesterol Sigma-Aldrich | ||
| Colesterol | Sigma-Aldrich | ||
| 3-sulfato de sodio | Sigma-Aldrich | ||
| D-Eritro-Dihidroesfingosina | Sigma-Aldrich | ||
| DI agua | purificada con Milipore(18.2MΩ) | ||
| Analizador de piel Gen2-SCA | River Diagnostics, Róterdam, Países Bajos | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erytro-esfingosina | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-lignoceroil-D-eritro-esfinganina (ceramida) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Ácido oleico | Sigma-Aldrich | ||
| Ácido palmítico | Sigma-Aldrich | ||
| Ácido palmitoleico | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox versión 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Róterdam, Países Bajos | versión 3.2 | |
| Escualeno | Sigma-Aldrich | ||
| Ácido esteárico | Sigma-Aldrich |
Referencias
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Espectroscopia Raman confocalAnálisis quimiométricoAgua proteínas lípidosResolución de profundidadAnálisis de componentes principalesResolución de curvas multivariantesEliminación de valores atípicosCorrección de la línea baseDetección de la superficie cutáneaProcesamiento de conjuntos de datos espectrales
