Obtención de vesículas híbridas unilamelares gigantes por electroformación y medición de sus propiedades mecánicas por aspiración de micropipeta

Resumen

El objetivo del protocolo es medir de forma fiable las propiedades mecánicas de membrana de las vesículas gigantes por aspiración de micropipetas.

Resumen

Las vesículas gigantes obtenidas a partir de fosfolípidos y copolímeros pueden explotarse en diferentes aplicaciones: administración controlada y dirigida de fármacos, reconocimiento biomolecular dentro de biosensores para el diagnóstico, membranas funcionales para células artificiales y desarrollo de micro/nanorreactores bioinspirados. En todas estas aplicaciones, la caracterización de sus propiedades de membrana es de importancia fundamental. Entre las técnicas de caracterización existentes, la aspiración de micropipetas, pionera por E. Evans, permite la medición de las propiedades mecánicas de la membrana, como el módulo de compresibilidad de área, el módulo de flexión y la tensión y la tensión de lisis y la tensión y la tensión. Aquí, presentamos todas las metodologías y procedimientos detallados para obtener vesículas gigantes a partir de la película delgada de un lípido o copolímero (o ambos), la fabricación y tratamiento superficial de micropipetas, y el procedimiento de aspiración que conduce a la medición de todos los parámetros mencionados anteriormente.

Introducción

Las vesículas gigantes obtenidas a partir de fosfolípidos (liposomas) han sido ampliamente utilizadas desde la década de 1970 como la membrana celular básica modelo^1. A finales de la década de 1990, las morfologías vesiculares obtenidas del autoensamblaje de copolímeros, denominados polímeros en referencia a sus análogos de lípidos^2,3,aparecieron rápidamente como una alternativa interesante a los liposomas que poseen una débil estabilidad mecánica y una pobre funcionalidad química modular. Sin embargo, su carácter biomimético celular es bastante limitado en comparación con los liposomas....

Protocolo

1. Fabricación de micropipetas

NOTA: Aquí son necesarias micropipetas con un diámetro interior de 6 a 12 m y una longitud córnea de alrededor de 3-4 mm. A continuación se describe un método detallado de fabricación de micropipetas.

1. Coloque el capilar de vidrio borosilicato en la barra de tracción del tirador y fije uno de los extremos apretando la perilla.
2. Deslice cuidadosamente el vidrio a través de los orificios en el lado de la cámara del calentador.
3. Apriete la perilla de sujeción en el otro extremo.
4. Controle el tamaño de la punta y la longitud del cónico para lograr las especificaciones deseadas. ....

Resultados

Con el protocolo antes mencionado, hemos estudiado diferentes vesículas unilamellares gigantes sintéticas (GUV), obtenidas a partir de un fosfolípido: 2-oleoyl-1-palmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), un copolímero tribloque: Poli(etilenoóxido)-b-Poli(dimethylsiloxane)-b-Poly(etilóxido) (PEO₁₂-b-PDMS₄₃-b-PEO₁₂) sintetizado en un estudio anterior¹³, y un copolímero dibloque Poly(dimeth.......

Discusión

El recubrimiento del micropipeta es uno de los puntos clave para obtener mediciones fiables. Se debe evitar la adhesión de la vesícula a la micropipeta, y se utiliza comúnmente un recubrimiento en la literatura^{17,18,19,20,21}, con BSA, é-caseína o surfasil. Los detalles del procedimiento de recubrimiento rara vez se mencionan.

La dis.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipos y materiales necesarios para el diseño de micropipetas
Borosilicato Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4	exterior e interior de 1 mm y 0,58 mm respectivamente.
Filamento instalado	por Sutter Instrument Co.	FB255B	2,5 mm * 2,5 mm Caja de filamento
Flaming/Marrón Extractor de micropipetas	Sutter Instrument Co.	Modelo P-97
Microforge	NARISHGE Co.	MF-900	equipado con dos objetivos (10x y 32x
)Materiales para el recubrimiento de puntas de pipeta con BSA
Bovine Fracción de Albúmina Suero V (BSA)	Sigma-Aldrich	10735078001
Jeringa desechable de 1 ml Luer Tip	Codan	62.1612
Jeringa desechable de 10 ml Luer Tip	Codan	626616
Jeringa desechable de 5 ml Luer Tip	Codan	62.5607
Filtro de celulosa acetato desechable	Cluzeau Info Labo	L5003SPA	Tamaño de poro: 0.22µ m, diámetro: 25 mm
Tubo capilar de sílice fundida flexible Polymicro Technologies	.	TSP530660	Diámetro interior 536µ m, diámetro exterior 660µ m,Glucosa
	Sigma-Aldrich	G5767
Jeringa 500 y micro; L luer Lock GASTIGHT	Hamilton Syringe Company	1750
Mezclador giratorio de tubo de ensayo	Labinco	28210109
Micromanipulation Setup
aluminio, 1000 mm de longitud, roscas M4, serie X48 Newport
			Se utiliza como soporte del microscopio para evitar vibraciones externas.
Micromanipulador	Eppendorf	Patchman NP 2	La unidad modular (unidad de motor para el movimiento X, Y y Z) se monta en el microscopio invertido mediante un adaptador.
Micrómetro	Mitutoyo Corporation	350-354-10	Digimatic LCD Cabezal de micrómetro 25,4 mm Alcance 0,001 mm
Depósito de agua de plexiglás (100 ml)
(DMI6000) equipado con un escáner resonante y un objetivo de inmersión en agua (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I).	Leica
X48 de 80 mm de longitud, con rosca 1/4-20, 8-32 y 4-40	Newport
Materiales para la preparación de soluciones de sacarosa y anfifílico
2-Oleoyl-1-palmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Sigma-Aldrich
Cloroformo	VWR	22711.244
L-α-Fosfatidiletanolamina-N-(lissamina rodamina B sulfonil)	Sigma-Aldrich	810146C	Lípido marcado con rodamina
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S7903
Electroformación Configuración
10 y Micro; L tapones capilares de vidrio	Hirschmann	9600110
Jeringa desechable de 1 ml Luer Tip	Codan	62.1612
H Grasa	Apiezon	Apiezon H Grasa	sin silicona Portaobjetos de
vidrio recubierto de óxido de indio y estaño	Sigma-Aldrich
	Terumo	AN2138R1	0,8 x 38 mm
Ohmímetro (multímetro)	Voltcraft	VC140
Toluene	VWR	28676.297
Generador de tensión	Keysight	33210A

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