Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica

Resumen

Aquí se describe un protocolo para caracterizar módulos de miRNAs biológicamente sinérgicos y su ensamblaje en transgenes cortos, lo que permite la sobreexpresión simultánea para aplicaciones de terapia génica.

Resumen

La relevancia biológica de los microARN (miRNAs) en salud y enfermedad se basa significativamente en combinaciones específicas de muchos miRNAs desregulados simultáneamente en lugar de la acción de un solo miRNA. La caracterización de estos módulos miRNAs específicos es un paso fundamental para maximizar su uso en la terapia. Esto es extremadamente relevante porque sus atributos combinatoriales pueden ser prácticamente explotados. Aquí se describe un método para definir una firma específica de miRNA relevante para el control de los represores de cromatina oncogénica en el glioblastoma. El enfoque define primero un grupo general de miRNAs que se desreglamentan en los tumores en comparación con el tejido normal. El análisis se perfecciona aún más mediante condiciones de cultivo diferencial, subrayando un subgrupo de miRNAs que se expresan simultáneamente durante estados celulares específicos. Por último, los miRNAs que satisfacen estos filtros se combinan en un transgenes policistrónicos artificiales, que se basa en un andamio de genes de agrupaciones de miRNA naturalmente existentes, luego se utilizan para la sobreexpresión de estos módulos de miRNA en las células receptoras.

Introducción

los miRNAs ofrecen una oportunidad inigualable para el desarrollo de un enfoque amplio de terapia génica para muchas enfermedades^1,2,3, incluyendo el cáncer^4,5. Esto se basa en varias características únicas de estas moléculas biológicas, incluyendo su pequeño tamaño⁶, biogénesis simple^7,y tendencia natural a funcionar en la asociación^8. Muchas enfermedades se caracterizan por patrones específicos de expresión de miRNA, que a menudo convergen en la regulación de funciones biológicas complejas^9. El propósito de este método es primero definir una estrategia para identificar grupos de miRNAs que son sinérgicamente relevantes para funciones celulares específicas. En consecuencia, proporciona una estrategia para el restablecimiento de tales combinaciones de miRNA en estudios y aplicaciones posteriores.

Este método permite el análisis funcional de múltiples miRNAs a la vez, aprovechando su segmentación simultánea de un gran número de ARNm, recapitulando así los complejos paisajes de las enfermedades. Este enfoque se ha empleado recientemente para definir un grupo de tres miRNAs que 1) están simultáneamente regulados en cáncer cerebral y 2) muestran un fuerte patrón de coexpresión durante la diferenciación neuronal, así como en respuesta al estrés genotóxico por radiación o un Agente alquilante de ADN. La re-expresión combinatoria de este módulo de tres miRNAs por el método de agrupación que se describe a continuación da lugar a una profunda interferencia con la biología de las células cancerosas y se puede utilizar fácilmente como estrategia de terapia génica para estudios preclínicos¹⁰. Este protocolo puede ser de particular interés para los involucrados en la investigación de miRNA y sus aplicaciones traslacionales.

Protocolo

1. Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el Glioblastoma

1. Análisis de la expresión diferencial amplia de miRNA en glioblastoma vs.
   1. En primer lugar, determinar los MIRNAs más significativamente desregulados en el tumor. Esto se puede lograr utilizando al menos tres métodos diferentes:
      1. Mina el Atlas del Genoma del Cáncer, encontrado en https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, para la secuenciación de datos¹¹.
      2. Realizar análisis de microarray a partir de una nueva muestra operativa^12.
      3. Utilice conjuntos de datos publicados anteriormente¹³.
         NOTA: Cualquiera que sea el método elegido, la salida proporciona un conjunto masivo de miRNAs cuya expresión está estadísticamente correlacionada (ya sea directa o inversamente) con la biología tumoral. Este grupo inicial constituye el grupo de miRNAs que se analizan más a fondo para la identificación de un subconjunto de miRNAs que muestra la asociación funcional más estricta mediante la realización de un análisis más dinámico de los cambios de expresión, como se describe a continuación.
2. Análisis de expresión de miRNA específico de la condición
   1. Inducción de la diferenciación celular:
      1. Utilice platos de plástico de poli-d-lisina (PDL) pre-recubiertos para favorecer la formación de un cultivo monocapa. Para el recubrimiento de platos, disolver PDL en agua a una concentración de 100 g/ml. Utilizar 1 ml de solución por superficie de 25 cm^2. Enjuague 2x con PBS 6 h después de la aplicación de la solución PDL.
      2. Placa de células madre neuronales humanas en cantidades iguales (100.000 células/5 ml) ya sea en medio de células madre (medio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), medio de diferenciación astrocítica (DMEM + 10% FBS), o medio de diferenciación neuronal (medio neurobasal + B27 suplemento, +2 m de ácido retinoico)¹⁴. El protocolo para la diferenciación de oligodendrocitos requiere la adición de IGF-1 (200 ng/mL) después de la eliminación de EGF/FGF^14,15.
      3. Después del revestimiento de celdas, colóquelo en la incubadora durante 1 semana a 37oC, 5% CO_2.
   2. Extracción de ARN:
      1. Después de 7 días, retire las células de la incubadora y retire el medio.
      2. Lavar las células con PBS (5 ml). A continuación, agregue 1 ml de reactivo de lisis (ver Tabla de materiales)para atajar las células y raspar las células en un tubo de microfusión de 1,5 ml utilizando un rascador de células. Mantenga los tubos que contienen las células lysed a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
      3. Proceda al aislamiento total del ARN siguiendo las instrucciones del fabricante.
   3. Análisis de expresión de miRNA:
      1. Cuantifique la expresión diferencial de miRNAs específicos identificados en el paso 1.1 entre los tres patrones de diferenciación por PCR en tiempo real, utilizando sondas TaqMan y siguiendo los protocolos del fabricante para la transcripción inversa y la amplificación de PCR ( Figura 1).
3. Validación de clústeres de miRNA por desafíos específicos del estrés
   1. Cultivo G34 glioblastoma células similares a un tallo en medio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF. Comience con 1 x 10⁶ células en 5 ml en un matraz de 25 cm² de baja fijación.
   2. A partir de 48 h después del enchapado, añada concentraciones duplicados de agente alquilante de ADN temozolomida (TMZ) cada 5 días, de la siguiente manera:
      1. Comience con 5 m durante 5 días. Después de 5 días, retire el medio y reemplácelo por medio fresco sin temozolomida, para permitir que las células supervivientes se recuperen. Después de 48 h, añadir 10 m TMZ e incubar durante otros 5 días.
      2. Repita el paso 1.3.2.1, duplicando la concentración de TMZ cada vez, hasta que se alcance una concentración de al menos 100 m y las células se vuelvan resistentes al fármaco¹⁰.
   3. En un experimento paralelo, irradiar células G34 de la siguiente manera:
      1. A partir de 48 h después de chapar 1 x 10⁶ células en 5 ml en un matraz de 25 cm² de baja fijación, irradiar células con 2 Gy de energía (cualquier irradiador que proporcione emisión de fotones es aceptable). Devuelva las células a la incubadora y no moleste. Después de 48 h, irradiar las células de nuevo con 2 Gy adicionales de energía.
      2. Repita el paso 1.3.3.1 4x hasta que se administre un total de 10 Gy de energía.
      3. Devuelva las células a la incubadora y deje que se recuperen en medio fresco durante al menos 5 días antes del análisis posterior.
   4. Después de la inducción de la resistencia, las células de la lyse usando reactivo de lisis y extraer ARN total de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   5. Analice la expresión de los miRNAs específicos identificados en las secciones 1.1-1.2 como se describe en el paso 1.2.1(Figura 2).
4. Caracterización de la convergencia funcional de los miRNAs agrupados
   1. Obtenga el targetome previsto de cada miRNAs definido en las secciones 1.2-1.3 obtenidas mediante herramientas de predicción de segmentación de miRNA.
      NOTA: Generalmente recurrimos a TargetScan, ya que su algoritmo se actualiza periódicamente¹⁶. Las herramientas de predicción adicionales son miRanda¹⁷, miRDB¹⁸y DIANA-miRPath^19. Todos estos programas son aplicaciones gratuitas basadas en la web.
      1. En la página principal de Targetscan, seleccione el miRNA de interés en el menú desplegable rellenado previamente. Haga clic en el botón Enviar.
      2. Descargue la lista resultante de destinos como hoja de cálculo mediante el vínculo Descargar tabla (Figura complementaria 1).
      3. Para reducir las posibilidades de predicciones falsas positivas, incluya solo los destinos dentro de la columna de sitios conservados en los análisis posteriores. Además, se puede obtener más rigáscencia mediante el uso de programas de predicción de miRNA adicionales (ver arriba) y sólo incluyendo objetivos que son comunes a todos los algoritmos.
   2. Clasificar los targetomes resultantes de acuerdo con las categorías de Gene Ontology usando ToppGene Suite²⁰ para evaluar el enriquecimiento de las vías que son comunes a cada miRNA.
      1. Pegue la lista de objetivos obtenidos del paso 1.4.1 en la ventana "Conjunto de genes de entrenamiento", utilizando el símbolo HGNC como tipo de entrada. Haga clic en Enviar > Inicio. El programa proporcionará una tabla de salida que muestra las categorías "Go" más significativas para la lista introducida de genes(Figura Suplementaria 2).
   3. Para establecer finalmente la contribución de cada miRNA a la regulación de una vía común o proceso celular (en este caso, regulación de la cromatina), compruebe cada targetome obtenido en el paso 1.4.1 contra la lista completa de genes implicados en el proceso celular específico ( es decir, regulación de la cromatina), utilizando la función de diagrama de Venn proporcionada en el sitio web de Bioinformática y Genómica Evolutiva http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      NOTA: Este programa permite la intersección de varios grupos al mismo tiempo(Figura 3). Los objetivos únicos específicos proporcionados por cada miRNA se anotan y seleccionan para experimentos funcionales posteriores.
      1. En la primera página del programa, cargue o copie/pegue la lista si los ARNM de destino para cada miRNA o interés en las ventanas respectivas. Asigne un nombre a cada lista con un identificador único.
      2. Haga clic en Enviar. El programa proporcionará una salida visual de un diagrama de Venn con números de genes en cada sector, así como una lista completa de ARNm para cada subconjunto y combinaciones de intersección.

2. Montaje de módulos miRNA en un clúster policistrónico transgénico

1. Preparación de andamios transgénicos basados en el locus de racimo miR-17-92
   1. Obtenga la secuencia de nucleótidos del clúster miR-17-92 del navegador del genoma de Ensembl²¹. Seleccione la secuencia de "núcleo" del par base de 800 que abarca las seis horquillas miRNA codificadas del locus y al menos secuencias de flanqueo de 200 nucleótidos tanto aguas arriba (5') como aguas abajo (3') de la secuencia central.
   2. Pegue la secuencia anterior en cualquier programa de edición de palabras.
   3. Defina la secuencia de cada una de las seis horquillas nativas recuperándolas en miRBase²². Marque cada una de estas secuencias dentro del intervalo de la secuencia "núcleo" previamente identificada. Cualquier secuencia entre cada horquilla representa secuencias espaciadoras, que son importantes para el correcto procesamiento del transgén.
   4. Retire las secuencias de horquillas nativas de la secuencia "núcleo", con la excepción de 3-5 nucleótidos en los extremos de 5' y 3' de cada horquilla, que servirán como un aceptador para las nuevas horquillas.
2. Creación de un nuevo transgén que codifica varios miRNAs de elección
   1. Obtener secuencias de horquillas de miRNAs destinados a ser sobreexpresados en el transgén de miRBase. Tenga en cuenta cuidadosamente los nucleótidos específicos que son los sitios de la escisión del microprocesador.
   2. Sustituya las horquillas eliminadas (paso 2.1.4) por las secuencias de horquilladeras de los miRNAs deseados obtenidos en el paso 2.2.1.
   3. Agregue las secuencias de restricción deseadas en ambas regiones flanqueantes del transgén para facilitar la subcloning en vectores de entrega de su elección. Verifique que las secuencias de restricción elegidas no estén presentes dentro de la secuencia sí misma.
   4. Para controles negativos, utilice secuencias revueltas de 20 nucleótidos para reemplazar la secuencia natural de 20 nucleótidos de cada miRNA maduro. Genere estas secuencias codificadas utilizando una herramienta en línea como https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
3. Verificar la estructura bidimensional del transgén
   1. Copie la secuencia transgénica completa en el programa de software de predicción de estructura de ARN RNAweb Fold²³.
   2. Mediante la configuración estándar del programa, haga clic en Continuar.
   3. Analizar la salida gráfica, particularmente para la presencia de horquillas bien definidas y la presencia de estructuras de tallo de doble cadena al menos 11 nucleótidos proximales al sitio de escisión del microprocesador. Además, busque la ausencia de puntos de bifurcación dentro de las secuencias de horquilla(Figura 4).

3. Obtención de Transgenes por Síntesis de ADN

1. Después del diseño y en la validación en silico del cúmulo de miRNA quimérico, obtenga la secuencia de trabajo utilizando la síntesis de ADN de los proveedores comerciales²⁴ y proceda con la clonación aguas abajo en vectores y entrega de transgénicos. Hemos utilizado vectores lentivirales para la entrega in vitro¹⁰ y virus asociados a dedeno (AAVs) para la entrega in vivo intracraneal²⁵.

Resultados

Este método permitió la caracterización de un módulo de tres miRNAs que están constantemente regulados en tumores cerebrales, que se expresan específicamente durante la diferenciación neuronal(Figura 1) e implican en la respuesta de supervivencia tumoral después de terapia(Figura 2). Esto se logra mediante la regulación de una vía represiva de cromatina oncogénica compleja. Este patrón de co-expresión sugiere una fuerte actividad...

Discusión

Este protocolo se basa en la noción de que en lugar de funcionar de forma aislada, los miRNAs son biológicamente relevantes al trabajar en grupos, y estos grupos están determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos^26. Para justificar este enfoque desde una perspectiva traslacional, se introduce un protocolo de seguimiento que permite la recreación de este patrón multi-miRNA en células/tejidos. Esto es posible aprovechando la biogénesis relativamente simple de los miRNAs, por...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.4% agarosa a baja temperatura de fusión	IBI Scientific IB70058
0,45 y micro; M unidad de filtro estéril	Merck Millipore	SLH033RS
1,5 mL Tubo de microcentrífuga	Eppendorf	22431081
placas de 6 pocillos	Greiner Bio-One	657160
Ratones atímicos (FoxN1 nu/nu)	Envigo	069(nu)/070(nu/+)
B-27 Suplemento	Thermo Fisher Scientific	12587010
Matraz de cultivo celular	Greiner Bio-One	660175
Cell Scraper, 16cm	Sarstedt	83.1832
Irradiador de cesio 137	Instalación central de JL Sheperd and Associates	(Facultad de Medicina de Harvard)
Cloroformo	Sigma-Aldrich	439142-4L
DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato	Thermo Fisher Scientific 11995040
Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	14190144
solución Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009
Suero Fetal Bovino	Sigma-Aldrich	F9665
Solución de formalina	Sigma-Aldrich	HT501128
GlutaMAX Suplemento	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEK-293	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1573
Solución de hematoxilina	Sigma-Aldrich	1051750500
Células madre de glioma primario humano (GBM62)			Proporcionado por el Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Células madre de glioma primario humano (MGG4)			Proporcionado por el Dr. Hiroaki Wakimoto (Hospital General de Massachusetts, Boston, MA)
Vector lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP	System Biosciences	CD511B-1
Lipofectamine 2000	Microcentrífuga refrigerada Thermo Fisher Scientific	11668019
	Eppendorf	n.º de modelo 5424 R, n.º de cat.5404000138
Medio de montaje	Thermo Fisher Scientific	4112APG
Nalgene Tubos de centrífuga de fondo redondo de policarbonato de alta velocidad	Thermo Fisher Scientific	3117-0380PK
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	2000c
Células progenitoras neurales (NPC)			Proporcionado por el Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Medio Neurobasal		Thermo Fisher Scientific
Nikon eclipse Ti	Nikon, Japón	14314
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985088
tubos de PCR	Sigma-Aldrich	CLS6571-960EA
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122
94/16	Greiner Bio-One	632180
Poly-D-Lisina	Sigma- Aldrich	P4707
EGF humano recombinante;	PeproTech	AF-100-15
FGF humano recombinante-básico	PeproTech	AF-100-18B
Ácido retinoico	Gibco	12587-010
Kit de minipreparación de ARN	Direct-zol	R2050
S1000 Termociclador	Bio-Rad	1852196
Micro Irradiador Guiado por Imágenes para Pequeños Animales	Xstrahal Life Sciences, Reino Unido	Instalación central (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Ultracentrífuga Sorvall WX+	Thermo Fisher Scientific
StemPro Accutase		Thermo Fisher Scientific
StepOne	Applied Biosystems
Cabina de bioseguridad SterilGARD	The Baker Company	SG403A-HE
		S9378
T98-G	American Type Culture Collecti	ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Transcription Kit de transcripción inversa	Thermo Fisher Scientific 4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4324018
Temozolomida	Tocris Bioscience	2706
Tissue-Tek temperatura óptima de corte	Reactivo	NC9636948 de
	Thermo Fisher Scientific 15596026		Reactivo de lisis
U251-MG	Tipo americano Culture Collecti	ATCC HTB-17
U87-MG	Colección de cultura tipo americana	ATCC HTB-14
ViraPower Sistema de expresión lentivectorial	Thermo Fisher Scientific	K4970-00
Agua, grado HPLC	Fisher	W54
Xileno	Sigma-Aldrich	534056