Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para disociar y ordenar una población celular específica de las glándulas accesorias masculinas Drosophila (células secundarias) para la secuenciación de ARN y RT-qPCR. El aislamiento celular se logra a través de la purificación FACS de células secundarias que expresan GFP después de un proceso de disociación de múltiples pasos que requiere disección, digestión de proteasas y dispersión mecánica.

Resumen

Para entender la función de un órgano, a menudo es útil entender el papel de sus poblaciones celulares constituyentes. Desafortunadamente, la rareza de las poblaciones celulares individuales a menudo hace que sea difícil obtener suficiente material para estudios moleculares. Por ejemplo, la glándula accesoria del sistema reproductor masculino Drosophila contiene dos tipos distintos de células secretoras. Las células principales conforman el 96% de las células secretoras de la glándula, mientras que las células secundarias (SC) conforman el 4% restante de las células (alrededor de 80 células por macho). Aunque ambos tipos de células producen componentes importantes del líquido seminal, sólo unos pocos genes son conocidos por ser específicos de los SC. La rareza de los SC ha obstaculizado hasta ahora el estudio del análisis transcriptomico de este importante tipo de célula. Aquí, se presenta un método que permite la purificación de SC s c. para la extracción y secuenciación de ARN. El protocolo consiste primero en disección de glándulas de moscas que expresan un reportero de PfP específico de SC y luego sometiendo estas glándulas a digestión proteasa y disociación mecánica para obtener células individuales. Siguiendo estos pasos, las células individuales, vivas, marcadas con GFP se clasifican utilizando un clasificador de células activado sfluorescentes (FACS) para la purificación del ARN. Este procedimiento produce ARN específicos de SC de 40 machos por condición para la secuenciación de RT-qPCR y/o ARN aguas abajo en el transcurso de un día. La rapidez y simplicidad del procedimiento permite determinar en un corto período de tiempo los transcriptomas de muchas moscas diferentes, de diferentes genotipos o condiciones ambientales.

Introducción

Los órganos se componen de múltiples tipos de células, cada una con funciones discretas y a veces expresando conjuntos muy diferentes de genes. Para obtener una comprensión precisa de cómo funciona un órgano, a menudo es fundamental estudiar cada tipo de célula distinta que compone este órgano. Uno de los métodos principales utilizados para explorar la posible función es el análisis del transcriptoma. Este potente método proporciona una instantánea de la expresión génica en una célula, para revelar los procesos y vías activas. Sin embargo, este tipo de análisis es a menudo difícil para las poblaciones de células raras que deben ser purificadas a partir de células veci....

Protocolo

1. Líneas de Drosophila Utilizadas y Colección de Hombres

1. Para este protocolo, utilice machos que expresen GFP en los SC y no en las células principales. Aquí, se utiliza un controlador AbdB-GAL4 (descrito en la referencia^18),recombinado con UAS-GFP (en el cromosoma 2). También se pueden utilizar otros controladores apropiados. Para el aislamiento de SC sbajo diferentes condiciones mutantes, cruce la mutación en líneas que contengan la línea GFP específica de SC.
2. Recoger dos lotes de unos 25 machos vírgenes sanos por cada genotipo y envejecerlos a 25 oC durante 3-4 días en viales con alimentos ....

Resultados

El protocolo presentado aquí permite a un experimentador aislar las células secundarias de las glándulas accesorias masculinas Drosophila y extraer su ARN en el transcurso de un solo día(Figura 1).

Usamos la construcción Abd-B-GAL4 ¹⁸ para etiquetar las células secundarias (SC) pero no las células principales (MC) con GFP(Figura 2

Discusión

Los métodos para la disociación celular del tejido Drosophila como los discos imaginativos ya se describen²³. Nuestros intentos de simplemente utilizar estos procedimientos en las glándulas accesorias fracasaron, animándonos a desarrollar este nuevo protocolo. La digestión de la proteasa y la trituración mecánica fueron pasos críticos que tenemos problemas para el éxito del procedimiento, y por lo tanto colocamos muchas notas en las secciones 2 a 5 para ayudar a los experimentadores a obt.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos	VWR	734-2325
Microscopio binocular para disección
Prismático con fuente de luz para GFP
Bunsen
Draq7 0,3	mM BioStatus	DR71000
Microtubos de plástico 1,5 mL	Eppendorf
FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios
			disección fina
Suero fetal bovino	Gibco	10270-106	inactivado por calor antes de su uso
Platos de vidrio para disección
Cubitera
ImProm-II Sistema de transcripción inversa	Promega	A3800
Kit de purificación de ARN MasterPure	Epicentre	MCR85102
Nextera XT kit	illumina		https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS
Penicilina-Estreptomicina	casera Gibco	15070-063
Imprimaciones
Cebadores de hexámero
Kit RNA 6000 Pico	Agilent
Schneider' s Drosophila medio	Gibco	21720-001
SMARTer kit de síntesis de ADNc	Takara		https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits
SYBR select Master mix para CFX	aplicado biosystems	4472942
Thermo Shaker	Hangzhou Allsheng instrumentos	MS-100
Tipone 1250 μ L punta graduada	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μ L punta biselada	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzima	Gibco	12604013
Vortex

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