Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno

Summary

Se desarrolló un método de pulverización criogénica para procesar patas murinas utilizando un molino congelador de nitrógeno líquido para mejorar el rendimiento y la calidad del ARN o proteína extraída de los tejidos y permitir el análisis de perfiles moleculares asociados con Respuestas.

Abstract

La elaboración de perfiles de cambios moleculares en los tejidos locales es crucial para comprender los mecanismos de acción de los candidatos terapéuticos in vivo. En el campo de la investigación de la artritis, muchos estudios se centran en las articulaciones inflamadas que se componen de una mezcla compleja de hueso, cartílago, músculo, células estromales y células inmunitarias. Aquí, establecimos un método mecánico fiable y robusto para interrumpir las patas de ratón inflamadas en muestras pulverizadas homogéneas en un entorno croogénicamente controlado. Se procesaron lelíforos de proteínas y ARN para permitir las variables proteómicas y transcripcionales y la caracterización molecular de las vías de enfermedad relevantes en el tejido local.

Introduction

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica crónica con sinovitis simétrica persistente en las articulaciones y afectación articular adicional de órganos como la piel, el corazón, los pulmones y los ojos¹. Aunque las manifestaciones sistémicas de la respuesta inmunitaria son evidentes en pacientes humanos, una de las señas de identidad de la patología de la AR es la infiltración de células inmunitarias en el tejido sinovial y la proliferación de células fibroblastos sinoviales².

Al igual que la AR humana, el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón (CIA) provo....

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Janssen I+D.

1. Método de pulverización a base de molino de congelador criogénico

1. Al finalizar el estudio de la CIA, sacrificar ratones con 1.5% de isoflurano seguido de dislocación cervical.
2. El día del procesamiento de tejidos, enfríe previamente todos los instrumentos (espátulas, viales de molienda, etc.) sobre hielo seco durante un mínimo de 10 minutos.
3. Corte las patas traseras con una tijera en la línea de piel como se muestra en la Figura ....

Results

Aquí, mostramos una visualización representativa de la imagen de gel de ARN extraído de las patas delanteras de los ratones de la CIA en la Figura 2A. El ARNm 28S y la banda rRNA 18S indican que todas las muestras tienen una cantidad suficiente de ARN intacto. A continuación, mostramos una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones totales de proteínas basadas en el análisis de proteína BCA en la Figura 2.......

Discussion

Aunque existe una sólida lógica científica para evaluar las vías moleculares en los tejidos sinoviales, muchos informes sobre el perfil inmune del modelo de la CIA murina se centraron en la sangre periférica, mientras que los datos de análisis de proteínas y ARN de las patas inflamadas son bastante limitados. Hay varias razones posibles para este sesgo: las articulaciones del tobillo murino no son más grandes que 2 cm; las zonas afectadas consisten en piel, hueso y tejidos conectivos que a menudo son difíciles de homogen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Perla de acero inoxidable de 5 mm	Qiagen	69989
beta-mercaptoetanol	Sigma	M6250	Agente reductor de muestras que inhibe las enzimas ARNASA
Kit de bioanalizador	Agilent	5067-1511 Kit de calificación de	ARN
b-mercaptoetanol	Sigma	M6250
Agua de grado de cultivo celular	Corning	25-055-CI
Agua Solución madre de lisis celular	Señalización celular	9803
Tubo Eppendorf	22363204	Microfuge	Eppendorf
Caja centrífuga de tubo Eppendorf	Nalgene	5055	Caja para sujetar tubos Eppendorf en disposición de tubo horizontal
Elastón Everlast 247 Balancín de velocidad variable	Benchmark Scientific	BR5000
Molino congelador	Spex Sample Prep	6875	Congelador/Molino para el procesamiento de patas en polvo
pulverizado Vial de molienda	Spex Sample Prep	6801	Frasco de policarbonato para el procesamiento de patas en polvo pulverizado
Kit Pierce BCA Pierce		23225	Kit para la cuantificación de proteínas totales
Inhibidor de la proteasa Set de cócteles 1	Calbiochem	539131	Inhibidores de
la proteasaKit de proteínas BCA	Pierce	23225
Quantigene Kit	Thermofisher	QP1013	Kit de análisis de ADNb
Microcentrífuga	refrigerada Eppendorf	5417R	Tampón de centrifugación
RLT	Qiagen	79216	Tampón de extracción de ARN
Mini kit RNeasy	Qiagen	74104	que incluye columna RNeasy, tampón RLT y tampón RW1
	Agitador Benchmark Scientific	BR5000	basculante/agitadora
	VWR	10806-412	Espátula para la transferencia de polvo
Cordón de acero inoxidable	Qiagen	69989	Perla para mezclar durante la extracción de proteínas
Extractor de tubo	Spex Sample Prep	6884	Extractor para quitar la parte superior del vial de molienda
Vortexer	VWR	10153-838	Mezcla de muestras