La integridad de la barrera hematoencefálica es fundamental para la función del sistema nervioso. En Drosophila melanogaster, la barrera hematoencefálica se forma por células gliales durante la embriogénesis tardía. Este protocolo describe los métodos para el ensayo para la formación y el mantenimiento de barreras hematoencefálicas en embriones D. melanogaster y larvas de tercera estrella.
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Artículo de método
Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo adecuado del sistema nervioso incluye la formación de la barrera hematoencefálica, la barrera de difusión que regula estrechamente el acceso al sistema nervioso y protege el tejido neural de toxinas y patógenos. Los defectos en la formación de esta barrera se han correlacionado con las neuropatías, y la descomposición de esta barrera se ha observado en muchas enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es fundamental identificar los genes que regulan la formación y el mantenimiento de la barrera hematoencefálica para identificar posibles dianas terapéuticas. Con el fin de entender las funciones exactas que estos genes juegan en el desarrollo neuronal, es necesario determinar los efectos de la expresión génica alterada en la integridad de la barrera hematoencefálica. Muchas de las moléculas que funcionan en el establecimiento de la barrera hematoencefálica se han encontrado para ser conservadas a través de especies eucariotas, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Las moscas de la fruta han demostrado ser un excelente sistema modelo para examinar los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo y la función del sistema nervioso. Este protocolo describe un procedimiento paso a paso para el ensayo de la integridad de la barrera hematoencefálica durante las etapas embrionarias y larvales del desarrollo de D. melanogaster.
Introducción
Durante el desarrollo, la comunicación celular y las interacciones son fundamentales para el establecimiento de la estructura y función de tejidos y órganos. En algunos casos, estas interacciones células-células sellan los órganos del entorno circundante para asegurar el funcionamiento adecuado del órgano. Este es el caso del sistema nervioso, que está aislado por la barrera hematoencefálica (BBB). Disfunción del BBB en seres humanos se ha relacionado con trastornos neurológicos incluyendo epilepsia, y la descomposición de la barrera se ha observado en enfermedades neurodegenerativas incluyendo esclerosis múltiple y esclerosis lateral amiotrófica1
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Protocolo
1. Recogida de muestras
- Colección embryo
- En cada jaula de recolección de embriones, utilice un mínimo de 50 hembras vírgenes con 20 a 25 machos para las colecciones. Incubar estas moscas en una botella con alimentos de agar harina de maíz(Tabla de Materiales)durante 1 a 2 días antes de comenzar las colecciones23.
NOTA: Se pueden utilizar más moscas, pero la proporción de mujeres a hombres debe mantenerse en 2:1. - Platos de agar jugo de manzana pre-caliente(Tabla 1) a 25oC durante la noche.
NOTA: Esto es necesario para la puest....
- En cada jaula de recolección de embriones, utilice un mínimo de 50 hembras vírgenes con 20 a 25 machos para las colecciones. Incubar estas moscas en una botella con alimentos de agar harina de maíz(Tabla de Materiales)durante 1 a 2 días antes de comenzar las colecciones23.
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Resultados
Los métodos descritos aquí permiten la visualización de la integridad del BBB en todo el SNC en embriones y larvas de D. melanogaster (Figura 1). Una vez completada la formación de BBB en la embriogénesis tardía, el BBB funciona para excluir moléculas grandes del cerebro y VNC5. Este protocolo aprovecha esta función para probar la formación BBB. Cuando se inyectaron embriones de tipo salvaje (Oregon R) en etapa tardía 17 (20-21 h de edad) con 10 kDa de dextra.......
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Discusión
Este protocolo proporciona una descripción completa de los pasos necesarios para el ensayo para la integridad de BBB durante las etapas larantes de D. melanogaster de D. melanogaster. Se han descrito enfoques similares en otros lugares para probar la integridad del BBB durante el desarrollo, así como en las etapas adultas5,7,29,30. Sin embargo, las descripciones de los procedimientos e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. F. Bryan Pickett y al Dr. Rodney Dale por el uso de equipos para inyección. Este trabajo fue financiado por fondos de investigación de la Universidad Loyola de Chicago a M.D., D.T., y J.J.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10 kDa sulforrodamina 101 cloruro ácido (Texas Red) Dextrano | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran debe diluirse en ddH2O esterilizado en autoclave a una concentración de 25 mg/mL. |
| 20 μ L Puntas de pipeta con carga de gel | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% etanol (200 grados) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Levadura seca activa | Red | ||
| Star Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarosa | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Compresor de aire | DeWalt | D55140 | |
| Jugo | de manzana Mott's Jugo | ||
| Lejía Lejía | 1-5% Hipoclorito | ||
| Borosilicato Capilares de vidrio World | Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Tapones para botellas Fisher | Scientific | AS-277 | |
| Coladores de células | BD Falcon | 352350 | |
| Microscopio confocal | Olympus | FV1000 | Muestras fotografiadas con objetivo 20x (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Aplicador con punta de algodón | Puritan | 19-062614 | |
| Cinta adhesiva de doble cara | Pinzas Scotch | ||
| Dumont de 1/2"; Patrón #5; .05 x .01 mm Punta | Roboz | RS-5015 | |
| Botellas de comida para moscas | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Viales de comida para moscas | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad 1704422 | ||
| Bandeja de gel | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipeta | VWR | 14673-010 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Azúcar | Comprado en la tienda de comestibles. | ||
| Laboratorio de Aceite de Halocarbono | Científico, Inc. | FLY-7000 | |
| Fuente de luz | Schott | Ace I | |
| Manipulador Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulador | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Portaagujas | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Juegos de filtros Nightsea | Ciencia de la microscopía electrónica | SFA-LFS-CY | Para la visualización del |
| sistema de adaptador completo YFP Nightsea con cabezal de luz de color azul real | Ciencia de la microscopía electrónica | SFA-RB | Para la visualización de GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipeta | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Bomba neumática | World Precision Instruments | PV830 | Esto también se conoce como microinyector o regulador de presión. Dado que el modelo utilizado en nuestro estudio ya no está disponible, esta es una alternativa. |
| Cloruro de potasio | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Fosfato de potasio dibásico | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Jaulas de recolección de embriones pequeños | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Fosfato de sodio dibásico anhidro | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Placa base de acero | World Precision Instruments | 5052 | |
| Microscopio estereoscópico | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Se utiliza para la disección de tejidos. |
| Microscopio estereoscópico con fuente de luz transmitida | Baytronix | Se utiliza para inyección. | |
| Tegosept (ácido p-hidroxibenzoico, éster metílico) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Tapones de vial surfactantes no iónicos |
| Fisher Scientific | AS-273 |
Referencias
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate br....
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Reimpresiones y permisos
