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Artículo de método

Análisis del metabolismo de células hematopoyéticas del progenitor del tallo

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DOI:

10.3791/60234

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9 de noviembre de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

En este artículo

Resumen

Células progenitoras hematopoyéticas (HSPC) transición de un estado de reposo a un estado de diferenciación debido a su plasticidad metabólica durante la formación de sangre. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la respiración mitocondrial y la glucólisis de los HSCCP.

Resumen

Las células progenitoras hematopoyéticas del tallo (HSpC) tienen una plasticidad metabólica distinta, lo que les permite pasar de su estado de reposo a un estado de diferenciación para sostener las demandas de la formación de sangre. Sin embargo, ha sido difícil analizar el estado metabólico (respiración mitocondrial y glucólisis) de los HSCCP debido a su número limitado y la falta de protocolos optimizados para los HSCCP no adherentes y frágiles. Aquí, proporcionamos un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para medir la respiración metabólica (tasa de consumo de oxígeno; OCR) y glicólisis (tasa de acidificación extracelular; ECAR) de la médula ósea murina-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo proporciona una mayor cantidad de HSCCP LSK de la médula ósea murina, mejora la viabilidad de los HSCCP durante la incubación, facilita los análisis de flujo extracelular de los HSCCP no adherentes y proporciona protocolos de inyección optimizados (concentración y tiempo) para fármacos dirigidos a la fosforilación oxidativa y vías glucolíticas. Este método permite la predicción del estado metabólico y la salud de los HSCCP durante el desarrollo de la sangre y enfermedades.

Introducción

Dado que la vida útil de la mayoría de las células sanguíneas maduras es corta, la homeostasis de la sangre se basa en la auto-renovación y diferenciación de una población larga pero rara de células madre hematopoyéticas (HSCCP)1. Los HSCCP están en reposo, pero son rápidos para proliferar y se someten a una diferenciación al ser estimulación para sostener las demandas del sistema sanguíneo. Como cada estado celular hSPC requiere una demanda bioenergética única, los cambios metabólicos son factores clave de las decisiones del destino de HSPC. Por lo tanto, la pérdida de plasticidad metabólica, al alterar el equilibrio entre la reposo, la auto-renovación y la diferenciación de los HSCCP, a menudo conduce a trastornos mielo-o linfo-proliferativos. Juntos, la comprensión de la regulación metabólica del desarrollo de la HSPC es fundamental para descubrir mecanismos subyacentes a las neoplasias malignas hematológicas2,3,4,5.

La respiración mitocondrial y la glucólisis generan ATP para impulsar las reacciones intracelulares y producir los bloques de construcción necesarios para la síntesis de macromoléculas. Dado que los HSCCP tienen una masa mitocondrial baja en comparación con las células diferenciadas6 y sostienen la reposo en nichos hipoxicos de médula ósea, los HSCCP dependen principalmente de la glucólisis. La activación de los HSCCP mejora su metabolismo mitocondrial que conduce a la pérdida de reposo y su posterior entrada en el ciclo celular. Dicha plasticidad metabólica de hSCCP permite el mantenimiento de la piscina HSPC a lo largo de la vida adulta6,7,8,9,10,11,12. Por lo tanto, es fundamental investigar sus actividades metabólicas, como la tasa de consumo de oxígeno (OCR; índice de fosforilación oxidativa) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR; índice de glucólisis) para analizar la activación de la HSPC y el estado de salud. Tanto el OCR como el ECAR se pueden medir simultáneamente, en tiempo real, utilizando un analizador de flujo extracelular. Sin embargo, el método actual requiere un gran número de celdas y está optimizado para las celdas adherentes13. Dado que los HSCCP no se pueden aislar en grandes cantidades de ratones14,requieren clasificación para obtener una población pura, son células no adherentes15,y no se pueden cultivar durante la noche sin evitar la diferenciación16,ha sido difícil medir el OCR y el ECAR de HSCCP. Aquí, proporcionamos un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para acompañar tutoriales basados en vídeo sobre cómo medir la respiración metabólica y glucólisis de pocos miles de miles de médula ósea murinos-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs.

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Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil (IACUC).

NOTA: El protocolo se describe en orden cronológico que abarca el período de dos días. Utilice reactivos frescos como se describe en el protocolo siguiente.

1. Preparación de los reactivos el día anterior al ensayo

  1. Hidratar el cartucho del sensor.
    1. Incubar 5 ml del calibrante(Tabla de Materiales)en una incubadora no CO2 37 oC durante la noche.
    2. Abra el kit de ensayo de flujo(Tabla de materiales)y separe el cartucho del sensor (verde; superior) de la placa de servicios públicos (transparente; inferior). A continuación, coloque el cartucho del sensor boca abajo y adyacente a la placa de servicios públicos.
    3. Con agua estéril, llene los pozos de la placa de servicios públicos (200 l) y las cámaras alrededor de los pozos (400 l).
    4. Sumerja el cartucho del sensor en la placa de servicios para asegurarse de que los sensores estén completamente cubiertos por agua. Toque 3x para evitar la formación de burbujas.
    5. Coloque el cartucho sumergido en la placa de servicio en una incubadora no CO2 37 oC durante la noche. Para evitar la evaporación del agua, asegúrese de que la incubadora esté debidamente humidificada. Coloque un vaso de precipitados abierto que contenga H2O como precaución adicional junto a la placa de utilidad del cartucho, especialmente si utiliza un horno normal.
  2. Prepare la placa de ensayo.
    1. Esterilice la superficie del gabinete de bioseguridad clase 2 utilizando 70% de etanol. Abra la placa de ensayo debajo del capó.
    2. Añadir 40 ml de solución de poli-L-lisina (PLL) disponible en el uso comercial a cada pocal de la placa de ensayo bajo el capó.
    3. Cubra la placa de ensayo con la tapa incluida en el kit. Incubar la placa de ensayo cerrada a temperatura ambiente (RT) bajo el capó durante 1 h.
      NOTA: El objetivo de la incubación es dejar que la PLL recubra la superficie de la placa de ensayo para facilitar la adhesión de las células de suspensión a la superficie de la placa de ensayo.
    4. Después de 1 h de incubación de la placa de ensayo, retire el exceso de solución con un aspirador estéril a base de vacío y seque al aire el pozo debajo de la campana.
      NOTA: Se tarda n.o 30 a 60 minutos en secar al aire los pozos de la placa de ensayo después de la extracción excesiva de PLL con el aspirador.

2. Día del ensayo

  1. Prepare el cartucho.
    1. Levante el cartucho del sensor. Colóquelo boca abajo en la campana de cultivo de tejido y deseche el agua de la placa de servicios públicos.
    2. Llene los pozos de la matrícula con 200 ml del calibrador precalentado.
    3. Llene las cámaras alrededor de los pozos con 400 s de calibrador.
    4. Sumerja el cartucho del sensor en la placa de servicios públicos, asegurándose de que los sensores estén completamente cubiertos por el calibrador. Toque 3x para evitar la formación de burbujas.
    5. Equilibrar el cartucho del sensor sumergido en la placa de servicios públicos en una incubadora no CO2 37 oC durante 45 x 60 min.
  2. Cosechar HSCCP LSK derivados de la médula ósea de la murina.
    1. Para acomodar suficientes réplicas biológicas, planee utilizar HSCCP derivados de un ratón por pozo de la placa de ensayo.
      NOTA: Este método de recolección de médula ósea proporciona HSCC LSK de 50.000 a 80.000 HSCC de cada ratón. Este protocolo para medir el flujo extracelular está optimizado para HSCCP LSK de 70.000 euros por pozo de una placa de 96 pozos.
    2. Ratones eutanasiado utilizando sobredosis de CO2 y luxación cervical, siguiendo los métodos locales aprobados por la IACUC.
    3. Esterilice la superficie de las herramientas de diselación y el banco con un 70% de etanol.
    4. Para cada ratón, rellene previamente una placa Petri con 1 solución salina con fosfato (PBS) que contenga un 2% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor en RT.
      NOTA: No utilice PBS preenfriado, ya que creará grumos en los pasos siguientes.
    5. Rocíe 70% de etanol (v/v) en todo el ratón eutanizado. Aísle todos los huesos, incluidas las extremidades superiores e inferiores, los huesos de la cadera, el esternón, la caja torácica y la columna vertebral, del ratón17,18. Extraiga la materia blanca de la médula espinal del ratón, ya que puede contaminar las células LSK. Colocar todos los huesos en 1pbS (+ 2% FBS), ya que se están recolectiendo, en un plato de Petri hasta su uso posterior.
    6. Invierta un tubo cónico de 50 ml (nuevo cada vez) y utilícelo para triturar huesos sumergidos en 1pbS (+ 2% FBS) en la placa Petri.
    7. Usando una pipeta serológica de 10 ml, pipeta hacia arriba y hacia abajo (10x) para eliminar uniformemente las células de los huesos, después de triturar los huesos.
    8. Coloque un colador de células de 40 m en un tubo cónico de 50 ml. Prehumedezca la superficie del colador pasando 1 ml de 1pbS (+ 2% FBS).
    9. Cosecha la suspensión celular derivada de la médula ósea del paso 2.2.7 y pasala a través de la superficie prehúmeda del colador celular para eliminar los desechos óseos.
    10. Repita los pasos 2.2.6 a 2.2.9 hasta que todos los materiales óseos se vuelvan blancos como un marcador de que la mayoría de las células de la médula ósea se recogen en el tubo cónico de 50 ml.
      NOTA: A menudo se necesitan dos tubos cónicos de 50 ml por ratón para recoger todas las células derivadas de la médula ósea.
    11. Centrífuga 50 ml tubos cónicos que contienen células derivadas de la médula ósea durante 5 min a 500 x g y RT.
    12. Retire el sobrenadante. Resuspender las células derivadas de la médula ósea (combinar el contenido de ambos tubos de 50 ml) en 5 ml de 1pbS (+ 2% FBS) como volumen final y mantener las células en RT.
  3. Cosecha de células de médula ósea murina mononucleada.
    1. Añadir 5 ml de medio de gradiente de densidad (es decir, Ficoll) a un tubo cónico de 15 ml. Luego agregue lentamente 5 ml de la suspensión de la médula ósea. Asegúrese de que las celdas permanezcan como una capa por encima del medio de gradiente de densidad.
    2. Centrífuga durante 30 min a 500 x g y RT. No utilice un freno en la centrífuga. Asegúrese de que la centrífuga esté en la aceleración más baja posible (por ejemplo, 1 aceleración y 0 desaceleración).
    3. Cosecha la interfaz media de las células mononucleadas (color blanco) después de la centrifugación en un tubo cónico fresco de 15 ml.
    4. Células de lavado, cosechadas a partir de un medio de gradiente de densidad, con 5 ml de 1x PBS (+ 2% FBS). Centrífuga durante 5 min a 500 x g y 4oC. Retire el sobrenadante.
    5. Repita el paso 2.3.4.
    6. Resuspenda el contenido celular del tubo en 300 ml de 1PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 l de suspensión celular para control sin manchas o de un solo color en un tubo FACS.
  4. Cosecha HSPC LSK de células de médula ósea murina mononucleada.
    1. Haga un cóctel de biotina-anticuerpos mezclando 3 l por muestra de los siguientes anticuerpos: Gr1, Cd8a, Cd5, B220, Ter119. Añadir 15 l del cóctel de biotina-anticuerpos a 300 l de células de médula ósea mononucleadas.
      NOTA: Cada anticuerpo se utiliza a 1:100 de dilución.
    2. Incubar las células con el cóctel de biotina-anticuerpo durante 30 min a 4 oC con agitación para evitar que las células se agrupen en la parte inferior del tubo.
    3. Añadir 10 ml de 1x PBS pre-enfriado (+ 2% FBS) a las células mezcladas con el cóctel de anticuerpos biotina.
    4. Centrifugar el tubo durante 5 min a 500 x g y 4oC. Deseche el sobrenadante y resuspenda el gránulo celular en 400 éL de 1x PBS (+ 2% FBS). Aliquot 10 l para el control de un solo color de estreptavidina.
    5. Brevemente vórtice microbiotina microperlados(Tabla de Materiales)antes de su uso. Añadir 80 l de microperlas a cada muestra de célula (de 400 l). Mezclar bien e incubar durante 20 min adicionales a 4oC, con agitación.
    6. Agregue 10 ml de 1x PBS pre-enfriado (+ 2% FBS) a las células. Centrifugar el tubo durante 5 min a 500 x g y 4oC.
    7. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de 1pbS (+ 2% FBS). Almacenar a 4oC mientras se configura la unidad de separación magnética.
    8. Coloque una columna(Tabla de materiales)en el campo magnético del separador de clasificación de células asistidas magnéticas (MACS) a 4 oC. Preparar la columna para la separación magnética enjuagándola con 3 ml de 1pbS (+ 2% FBS) bajo el flujo de gravedad a 4 oC.
    9. Agregue la suspensión de la célula desde el paso 2.4.7 a la columna prehúmeda a 4 oC. Permita que las células pasen a través de la columna a 4 oC y recoja efluentes en un tubo cónico de 15 ml.
      NOTA: La fracción con celdas sin etiquetar en dicho efluente representa las celdas negativas de linaje enriquecido.
    10. Columna de lavado con 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) a 4oC. Repita 3x. Recoger el flujo a través y mantenerlo a 4 oC. Cuente las células viables eluidas por exclusión azul trypan usando un hemocaquímetro.
    11. Centrifugar el tubo cónico de 15 ml que contiene el flujo a través de 5 min a 500 x g y 4 oC. Descarta el sobrenadante. Resuspenda las células en 0,5 ml de 1pbS (+ 2% FBS) y transfiera el contenido a un tubo FACS.
    12. Añadir 24 l del cóctel de anticuerpos LSK a cada 107 células. El cóctel de anticuerpos contiene la misma concentración de anticuerpos 450-streptavidin, anticuerpo saqueo PE-CY7-Sca1 y anticuerpo APC-c-Kit.
    13. Incubar durante 1 h a 4oC con agitación bajo la oscuridad (cubierta con papel de aluminio).
    14. Agregue 3 mL de 1x PBS (+ 2% FBS) al tubo FACS. Centrífuga durante 5 min a 500 x g y 4oC. Descarta el sobrenadante.
    15. Resuspenda las células etiquetadas con anticuerpos en 1 ml de 1 PBS (+ 2% FBS). Añadir 1 l de 1 mg/ml de yoduro de propidium a la suspensión celular justo antes de la clasificación.
    16. Filtrar el contenido del tubo FACS utilizando un colador de 40 m justo antes de clasificar las células LSK.
    17. Recoger células LSK, a través de la clasificación FACS, en tubo de 1,5 ml que contiene 0,5 ml de medios completos complementados con 2 mM de glutamina, 3 mg/ml de glucosa, 1 mM de piruvato, 1x trombopoietin (TPO), 1x factor de células madre (SCF), 0,5x penicilina/estreptomicina (P/S), pH 7.4 (Tabla 1).

3. Ensayos de respiración mitocondrial y glucólisis de HSCCP LSK

  1. Sembrado LSK en la placa de ensayo
    1. Centrifugar las células LSK del paso 2.4.17 durante 5 min a 500 x g y RT. Deseche el sobrenadante.
    2. Resuspender las células en medios completos a una concentración final de al menos 70.000 células/40 l.
    3. Contenido de la semilla de medios de 40 l (que contiene 70.000 células) en la placa de 8 pocillos recubierta con PLL del paso 1.2.4. Deje todos los pozos de esquina vacíos.
    4. Centrífuga durante 1 min a 450 x g y RT. No aplique el freno. Asegúrese de que las células estén unidas a la parte inferior del pozo con el microscopio invertido.
    5. Añadir 135 l de medios completos a las celdas de cada pocelo para un volumen final de 175 l. Añadir 175 ml de medios completos a las 2 esquinas de la placa como espacios en blanco.
    6. Incubar las células de la incubadora no CO2 durante 2 h a 37oC.
    7. Configure un programa para agregar medicamentos a cada pozo de la placa de pozo en el analizador utilizando una métrica descrita en la Tabla 2 (prueba de esfuerzo mitocondrial) y la Tabla 3 (prueba de esfuerzo de glucólisis).
      NOTA: Mientras las células están incubando, encienda el instrumento y asegúrese de que esté a 37 oC.
  2. Prueba de esfuerzo mitocondrial
    1. Preparar soluciones de stock de 45 m de oligomicina, cianuro de carbonilo de 50 m 4-(triflurometoxi)fenilhidrazona (FCCP) y soluciones de stock de 25 m de rotenona/antimicina A. Para preparar una solución de stock de oligomicina de 45 m, disuelva el contenido de la bolsa disponible comercialmente en 280 ml del soporte completo. Para preparar una solución de stock FCCP de 50 m, disuelva el contenido de la bolsa disponible comercialmente en 288 ml del soporte completo. Para preparar una solución de stock de 25 m de rotenona/antimicina A, disuelva el contenido de la bolsa disponible comercialmente en 216 ml del soporte completo.
    2. Saque el cartucho del sensor de la placa de servicios públicos de la incubadora y cargue sus puertos (A, B y C) de modo que cada pozo tenga una concentración final de oligomicina de 2 M, FCCP de 1,5 m y 0,5 m de rotenona/antimicina A según sea necesario, tras las métricas descritas en la Tabla 4 (para la tasa de consumo de oxígeno).
    3. Retire la tapa del cartucho del sensor montado en la placa de servicios y colóquela en la bandeja de instrumentos. Inicie la calibración que tardará 20 minutos.
    4. Después de la calibración, retire la placa de utilidad y sustitúyala por una placa de ensayo que contenga celdas LSK, que ahora se adhieren a la parte inferior del pozo.
    5. Pulse Continuar para iniciar el programa descrito en la Tabla 2. Después de la finalización del programa, recuperar los datos y analizarlos utilizando el software Wave Desktop.
      NOTA: Los datos generados a partir de los ensayos de flujo extracelular se pueden trazar utilizando la gráfica de puntos del software Wave Desktop o exportarse al programa de estadísticas basado en web.
  3. Prueba de esfuerzo de glicólisis
    1. Reconstituir la glucosa en 300 ml (100 mM), oligomicina en 288 sL (50 oM), glucosa 2-D (2-DG) en 300 l (500 ml) de medios completos de la bolsa disponible en el comercial.
    2. Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo (10x) para solubilizar los compuestos. Vortex el 2-DG durante aproximadamente 1 min para asegurar la disolución adecuada en los medios.
    3. Retire el cartucho del sensor de la incubadora. Cargue los puertos A a C siguiendo las métricas de dilución descritas en la Tabla 5 para obtener una concentración final de glucosa de 10 mM, oligomicina de 2 m y 50 mM 2 DG.
    4. Repita los pasos 3.2.3 y 3.2.4.
    5. Pulse Continuar para iniciar el programa descrito en la Tabla 3. Después de la finalización del programa, recuperar los datos y analizarlos utilizando el software Wave Desktop.

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Resultados

Nuestro método de extracción nos permitió cosechar hasta 80.000 HSCCP LSK por ratón. La viabilidad y el número de células LSK mejoraron con nuestro método, porque: (1) combinamos la médula ósea de las extremidades superiores e inferiores, los huesos de la cadera, el esternón, la caja torácica y la columna vertebral, (2) evitamos el uso de tampón de lisis de glóbulos rojos que habría aumentado la muerte celular y el aglutinamiento, (3) utilizó la separación del medio de gradiente de densidad de las células mononucleadas, ...

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Discusión

Aquí, demostramos el aislamiento de una cantidad máxima de población de HSCC LSK murinos puros y viables, así como la medición de su glucólisis y respiración mitocondrial con un analizador de flujo extracelular. Específicamente, el protocolo supera los siguientes problemas técnicos para el uso de HSCCP LSK : i) la baja frecuencia de HSCCP LSK en médula ósea murina14, ii) actividad metabólica basal baja de LSK HSCCP26, iii) la fragilidad de LSK HSCCP27

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo está en parte respaldado por el apoyo de financiación de los Institutos Nacionales de Salud (HL131645, CA016058), la Fundación St. Baldrick y la Fundación Pelotonia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de poli-L-lisina al 0,01% (p/v)SigmaP8920Se utiliza para el accesorio LSK
40 y micro; Fisher Scientific22-363-547Se utiliza para la filtración celular después de la trituración
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi130-090-485Se utiliza para la separación de Lin- Rata
biotina Anti-Ratón CD45R/B220 Clon RA3-6B2BD Biosciences553086utilizado para la separación de Lin-
Rata de biotina Anti-Ratón CD5 Clon 53-7.3BD Biosciences553019utilizado para Lin- separación
Biotina Rata Anti-Ratón CD8a Clon 53-6.7BD Biosciences553029Utilizado para la separación de Lin- Biotina
Rata Anti-Ratón Ly-6G y Ly-6C Clon RB6-8C5BD Biosciences553125Utilizado para la separación de Lin-
Biotina Rata Anti-Ratón TER-119 / Células eritroides Clon TER-119BD Biosciences553672Utilizado para la separación de Lin- Anticuerpo
monoclonal CD117 (c-Kit) (2B8), APCeBioscience17-1171-83Utilizado para la clasificación LSK
Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicosFalcon-Fischer Scientific14-959-53AUtilizado en el aislamiento
Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicosFalcon-Fischer Scientific14-432-22Utilizado en el aislamiento
Falcon Tubos de polipropileno de fondo redondo FalconFalcon-Fischer Scientific14-959-11AUtilizado para Clasificación LSK
Suero fetalbovino NeuromicsFBS001-HIUtilizado en tampón FACS
Histopaque-1083Sigma10831Utilizado para la separación en gradiente de ficoll
L-glutamina 100xFisher Scientific25-030-081Utilizado para los medios de ensayo
LS ColumnaMiltenyi130-042-401Utilizado para la separación de
Lin Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Anticuerpo (D7), PE-Cianina7eBioscience25-5981-82Utilizado para la clasificación de LSK
Factor de células madre murinas (SCF)PeproTech250-03-100UGUtilizado para los medios de ensayo
Trombopoyetina murina (TPO)PeproTech315-14-100UGUtilizado para los medios
de ensayo PBS 1%Fisher ScientificSH3002802Utilizado para el tampón FACS
Penicilina-Estreptomicina ( 10.000 U/mL)Fisher Scientific15140122Utilizado para los medios de ensayo
Yoduro de propidioFisher ScientificP1304MPUtilizado para la clasificación de LSK
Miniplaca de cultivo celular Seahorse XFpAgilent Technologies103025-100Utilizado para la siembra de LSK
Piruvato de sodio (100 mM)ThermoFisher11360070Utilizado para el medio de ensayo
Estreptavidina eFluor 450 ConjugadoeBioscience48-4317-82Utilizado para la clasificación de LSK
XF CalibrantAgilent Technologies100840-000Utilizado para el equilibrado de cartuchos
Medios XFAgilent Technologies103575-100Utilizado para los medios de ensayo
XFp Kit de prueba de esfuerzo de glucólisisAgilent Technologies103017100Fármacos para la prueba de esfuerzo de glucólisis
XFp Mitocondrial Kit de prueba de esfuerzoAgilent Technologies103010100Medicamentos para la prueba de esfuerzo mitocondrial
Cartucho de sensor XFpAgilent Technologies103022-100Se utiliza para la glucólisis y la prueba de esfuerzo mitocondrial
ósea de celular celular

Referencias

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