Células progenitoras hematopoyéticas (HSPC) transición de un estado de reposo a un estado de diferenciación debido a su plasticidad metabólica durante la formación de sangre. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la respiración mitocondrial y la glucólisis de los HSCCP.
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Artículo de método
Análisis del metabolismo de células hematopoyéticas del progenitor del tallo
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células progenitoras hematopoyéticas del tallo (HSpC) tienen una plasticidad metabólica distinta, lo que les permite pasar de su estado de reposo a un estado de diferenciación para sostener las demandas de la formación de sangre. Sin embargo, ha sido difícil analizar el estado metabólico (respiración mitocondrial y glucólisis) de los HSCCP debido a su número limitado y la falta de protocolos optimizados para los HSCCP no adherentes y frágiles. Aquí, proporcionamos un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para medir la respiración metabólica (tasa de consumo de oxígeno; OCR) y glicólisis (tasa de acidificación extracelular; ECAR) de la médula ósea murina-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo proporciona una mayor cantidad de HSCCP LSK de la médula ósea murina, mejora la viabilidad de los HSCCP durante la incubación, facilita los análisis de flujo extracelular de los HSCCP no adherentes y proporciona protocolos de inyección optimizados (concentración y tiempo) para fármacos dirigidos a la fosforilación oxidativa y vías glucolíticas. Este método permite la predicción del estado metabólico y la salud de los HSCCP durante el desarrollo de la sangre y enfermedades.
Introducción
Dado que la vida útil de la mayoría de las células sanguíneas maduras es corta, la homeostasis de la sangre se basa en la auto-renovación y diferenciación de una población larga pero rara de células madre hematopoyéticas (HSCCP)1. Los HSCCP están en reposo, pero son rápidos para proliferar y se someten a una diferenciación al ser estimulación para sostener las demandas del sistema sanguíneo. Como cada estado celular hSPC requiere una demanda bioenergética única, los cambios metabólicos son factores clave de las decisiones del destino de HSPC. Por lo tanto, la pérdida de plasticidad metabólica, al alterar el equilibrio entre la reposo, la auto-r....
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Protocolo
Este protocolo fue aprobado por el Comité Nacional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Infantil (IACUC).
NOTA: El protocolo se describe en orden cronológico que abarca el período de dos días. Utilice reactivos frescos como se describe en el protocolo siguiente.
1. Preparación de los reactivos el día anterior al ensayo
-
Hidratar el cartucho del sensor.
- Incubar 5 ml del calibrante(Tabla de Materiales)en una incubadora no CO2 37 oC durante la noche.
- Abra el kit de ensayo de flujo(Tabla de materiales)y ....
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Resultados
Nuestro método de extracción nos permitió cosechar hasta 80.000 HSCCP LSK por ratón. La viabilidad y el número de células LSK mejoraron con nuestro método, porque: (1) combinamos la médula ósea de las extremidades superiores e inferiores, los huesos de la cadera, el esternón, la caja torácica y la columna vertebral, (2) evitamos el uso de tampón de lisis de glóbulos rojos que habría aumentado la muerte celular y el aglutinamiento, (3) utilizó la separación del medio de gradiente de densidad de las células mononucleadas, .......
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Discusión
Aquí, demostramos el aislamiento de una cantidad máxima de población de HSCC LSK murinos puros y viables, así como la medición de su glucólisis y respiración mitocondrial con un analizador de flujo extracelular. Específicamente, el protocolo supera los siguientes problemas técnicos para el uso de HSCCP LSK : i) la baja frecuencia de HSCCP LSK en médula ósea murina14, ii) actividad metabólica basal baja de LSK HSCCP26, iii) la fragilidad de LSK HSCCP27
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo está en parte respaldado por el apoyo de financiación de los Institutos Nacionales de Salud (HL131645, CA016058), la Fundación St. Baldrick y la Fundación Pelotonia.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de poli-L-lisina al 0,01% (p/v) | Sigma | P8920 | Se utiliza para el accesorio LSK |
| 40 y micro; | Fisher Scientific | 22-363-547 | Se utiliza para la filtración celular después de la trituración |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Se utiliza para la separación de Lin- Rata |
| biotina Anti-Ratón CD45R/B220 Clon RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | utilizado para la separación de Lin- |
| Rata de biotina Anti-Ratón CD5 Clon 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | utilizado para Lin- separación |
| Biotina Rata Anti-Ratón CD8a Clon 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Utilizado para la separación de Lin- Biotina |
| Rata Anti-Ratón Ly-6G y Ly-6C Clon RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Utilizado para la separación de Lin- |
| Biotina Rata Anti-Ratón TER-119 / Células eritroides Clon TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Utilizado para la separación de Lin- Anticuerpo |
| monoclonal CD117 (c-Kit) (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Utilizado para la clasificación LSK |
| Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Utilizado en el aislamiento |
| Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Utilizado en el aislamiento |
| Falcon Tubos de polipropileno de fondo redondo Falcon | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Utilizado para Clasificación LSK |
| Suero fetal | bovino Neuromics | FBS001-HI | Utilizado en tampón FACS |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Utilizado para la separación en gradiente de ficoll |
| L-glutamina 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Utilizado para los medios de ensayo |
| LS Columna | Miltenyi | 130-042-401 | Utilizado para la separación de |
| Lin Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Anticuerpo (D7), PE-Cianina7 | eBioscience | 25-5981-82 | Utilizado para la clasificación de LSK |
| Factor de células madre murinas (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Utilizado para los medios de ensayo |
| Trombopoyetina murina (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Utilizado para los medios |
| de ensayo PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Utilizado para el tampón FACS |
| Penicilina-Estreptomicina ( 10.000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Utilizado para los medios de ensayo |
| Yoduro de propidio | Fisher Scientific | P1304MP | Utilizado para la clasificación de LSK |
| Miniplaca de cultivo celular Seahorse XFp | Agilent Technologies | 103025-100 | Utilizado para la siembra de LSK |
| Piruvato de sodio (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Utilizado para el medio de ensayo |
| Estreptavidina eFluor 450 Conjugado | eBioscience | 48-4317-82 | Utilizado para la clasificación de LSK |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Utilizado para el equilibrado de cartuchos |
| Medios XF | Agilent Technologies | 103575-100 | Utilizado para los medios de ensayo |
| XFp Kit de prueba de esfuerzo de glucólisis | Agilent Technologies | 103017100 | Fármacos para la prueba de esfuerzo de glucólisis |
| XFp Mitocondrial Kit de prueba de esfuerzo | Agilent Technologies | 103010100 | Medicamentos para la prueba de esfuerzo mitocondrial |
| Cartucho de sensor XFp | Agilent Technologies | 103022-100 | Se utiliza para la glucólisis y la prueba de esfuerzo mitocondrial |
Referencias
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. Internationa....
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