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Prospección de cepas microbianas para la biorremediación y el desarrollo de probióticos para la investigación y conservación de metaorganismos

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DOI:

10.3791/60238

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31 de octubre de 2019

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1LEMM, Laboratory of Molecular Microbial Ecology, Institute of Microbiology Paulo de Góes, Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2Genome Center, University of California, Davis, 3IMAM-AquaRio - Rio de Janeiro Aquarium Research Center

En este artículo

Resumen

La contaminación afecta a todos los biomas. Los ambientes marinos se han visto particularmente afectados, especialmente los arrecifes de coral, uno de los ecosistemas más sensibles de la Tierra. La biorremediación es la capacidad de los organismos para degradar los contaminantes. Aquí, describimos metodologías para aislar y probar microbios que presentan capacidad de biorremediación y características probióticas potenciales para corales.

Resumen

La contaminación afecta a todos los biomas. Los ambientes marinos se han visto particularmente afectados, especialmente los arrecifes de coral, uno de los ecosistemas más sensibles de la Tierra. A nivel mundial, 4.500 millones de personas dependen económicamente del mar, donde la mayor parte de su susmedios son proporcionadas por arrecifes de coral. Los corales son de gran importancia y por lo tanto su extinción conduce a consecuencias catastróficas. Existen varias soluciones posibles para remediar los contaminantes marinos y la contaminación local, incluida la biorremediación. La biorremediación es la capacidad de los organismos para degradar los contaminantes. El enfoque presenta varias ventajas, como la sostenibilidad, el costo relativamente bajo, y el hecho de que se puede aplicar en diferentes ecosistemas, causando impactos mínimos en el medio ambiente. Como una ventaja adicional, la manipulación de microbiomas endógenos, incluyendo microorganismos beneficiosos putativos para corales (pBMCs), puede tener efectos probióticos para animales marinos. En este contexto, el uso de los dos enfoques, la biorremediación y la inoculación de pBMC combinados, podría ser prometedor. Esta estrategia promovería la degradación de contaminantes específicos que pueden ser perjudiciales para los corales y otros metaorganismos, al tiempo que aumenta la resistencia y la resiliencia de los anfitriones para hacer frente a la contaminación y otras amenazas. Este método se centra en la selección de PBMCs para degradar dos contaminantes: el estrógeno sintético 17a-etinilestradiol (EE2) y el petróleo crudo. Ambos han sido reportados para afectar negativamente a los animales marinos, incluyendo los corales, y los seres humanos. El protocolo describe cómo aislar y probar bacterias capaces de degradar los contaminantes específicos, seguido de una descripción de cómo detectar algunas características beneficiosas putativas de estos microbios asociados a su huésped coralino. Las metodologías descritas aquí son relativamente baratas, fáciles de realizar y altamente adaptables. Casi cualquier tipo de compuesto objetivo soluble se puede utilizar en lugar de EE2 y aceite.

Introducción

La contaminación es un problema importante que afecta a la salud humana, animal y vegetal en todo el mundo. Aunque la contaminación puede ser natural, como las cenizas volcánicas1,las actividades humanas son la causa principal de la mayoría de la contaminación. Las actividades antropogénicas están contaminando el suelo, el agua y el aire, lo que directa o indirectamente conduce a casi 20 millones de muertes humanas prematuras2 y diezman miles de millones de otras formas de vida anualmente. Los contaminantes están presentes incluso en las zonas más remotas del planeta. Por ejemplo, se han detectado metales pesados y compuestos orgánicos persistentes en invertebrados de aguas profundas y mamíferos polares, respectivamente3,4.

Los ambientes marinos se han visto especialmente afectados por la contaminación. Durante mucho tiempo, se asumió que el océano no se vería afectado y suministraría una fuente interminable de bienes debido a su enorme volumen de agua5. Por esta razón, todo tipo de industria e instituciones liberó libremente residuos en cuerpos de agua durante los siglos6,7. Varios contaminantes de todos los tipos, como plástico8, hormonas sintéticas9, pesticidas10, aceite11, nutrientes12, metales pesados3y residuos radiactivos13 se han reportado como ecosistemas oceánicos. En este contexto, los arrecifes de coral se encuentran entre los ecosistemas más importantes y sensibles en los ambientes marinos14. Los arrecifes son protectores costeros, cruciales para el desarrollo de miles de especies marinas al desempeñar un papel esencial en el ciclo de nutrientes y el control del clima. Los arrecifes también contribuyen a la economía proporcionando pescado, bienes y turismo, entre otros15. Por ejemplo, 4.500 millones de personas dependen de los peces del océano como su principal fuente de alimento16,que son muy apoyados por los arrecifes de coral.

Independientemente de su importancia ecológica, social y económica, los arrecifes de coral están siendo diezmados17,18. Las actividades antropogénicas son las principales responsables de contribuir a las tres principales causas de muerte de los corales: el cambio climático, la sobrepesca y la contaminación del agua19. A pesar de que es importante trabajar en la mitigación del calentamiento global, también es importante trabajar en minimizar la contaminación local, incluida la contaminación del agua, que puede contribuir críticamente a la disminución del coral20. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollo de estrategias para aumentar la vida de los corales, lo que podría proporcionarles tiempo extra para adaptarse y sobrevivir.

En este sentido, es extremadamente importante encontrar soluciones para minimizar la contaminación y desarrollar estrategias para aumentar la aptitud de los corales. Las estrategias para remediar los contaminantes marinos son muy diversas y pueden agruparse en enfoques físicos, químicos y biológicos. Los enfoques físicos son útiles. Sin embargo, no siempre son eficientes. Por ejemplo, los residuos plásticos pueden minimizarse mediante la eliminación física, mientras que los compuestos solubles en agua necesitan otras metodologías para eliminarse. Ejemplos de estos compuestos son el petróleo crudo, liberado por las actividades y derrames de la industria petrolera, así como otros microcontaminantes, como las hormonas sintéticas, que normalmente se utilizan como componente estrogénico en los anticonceptivos orales y presentes en las aguas residuales21, 22. El uso de sustancias químicas para disminuir la contaminación puede resolver un problema específico, pero también puede representar una fuente adicional de contaminación. Este es el caso de los dispersantes químicos para mitigar la contaminación por petróleo, que han sido descritos como aún más tóxicos para los ecosistemas marinos que la contaminación del petróleo en sí23. Por estas razones, los enfoques biológicos presentan varias ventajas en comparación con los otros métodos. La biorremediación es la capacidad de los organismos vivos, o sus productos metabólicos, para transformar los contaminantes en formas menos tóxicas o no tóxicas24. Las principales ventajas de utilizar métodos biológicos son la sostenibilidad, el costo relativamente bajo, el hecho de que sean ecológicamente amigables, y que se puedan aplicar en diferentes ecosistemas, causando impactos mínimos o menos al medio ambiente21, 25,26,27.

Además, la manipulación de la comunidad microbiana presente en un entorno permite una ventaja potencial adicional. Hay microbiomas que están asociados con los huéspedes y son esenciales para su salud. Es bien sabido que estos microbiomas simbióticos asociados son necesarios para mantener la homeostasishuésped 19. La manipulación de estos microorganismos asociados ha sido bien explorada para huéspedes como plantas y mamíferos28,29, pero el uso de probióticos de coral sigue siendo novedoso15. Los corales también albergan, interactúan y dependen de grandes y específicas poblaciones de microorganismos para sobrevivir19. El papel de estas comunidades microbianas en la salud y la disbiosis de los corales está en estudio activo, pero todavía está lejos de ser plenamente entendido30. Una de las hipótesis más populares se llama la hipótesis de probióticos de coral. Sugiere la existencia de una relación dinámica entre los microorganismos simbióticos y las condiciones ambientales que da lugar a la selección de los metaorganismos coralinos más ventajosos31. Sobre la base de esta información, mecanismos probióticos potenciales clave, así como las estrategias de aislamiento, manipulación, y la entrega de microorganismos beneficiosos para corales (BMC) para varios propósitos, se propusieron32 y probado33. Estas características beneficiosas potenciales incluyen resistencia al aumento de la temperatura, protección contra especies reactivas de oxígeno (ROS), fijación de nitrógeno, resistencia a contaminantes y control biológico contra patógenos, entre otros32.

Este estudio se centra en la selección de BMC y microorganismos de vida libre que presentan la capacidad de degradar dos contaminantes comúnmente encontrados en ambientes marinos: el estrógeno sintético 17a-einilestradiol (EE2) y el petróleo crudo. Los contaminantes que contienen agentes activos hormonales a menudo están presentes en cuerpos de agua34,35,36,37,38,39,40, 41,42. Entre ellos, compuestos sintéticos estrogénicos-disruptores (EDC) imitan la acción de los estrógenos en las células diana, causando varios impactos en los animales, incluyendo el cáncer de mama, infertilidad, y hermafroditismo9. EE2 es excretado por los seres humanos debido al uso de anticonceptivos orales. Las plantas de tratamiento de aguas residuales tradicionales no se eliminan de las aguas residuales y tienen efectos negativos incluso a concentraciones muy bajas (p. ej., ng/L o g/L)43,44,45. Poco se sabe sobre los efectos de los estrógenos en la fisiología del coral46,47. Sin embargo, en otros invertebrados marinos, como esponjas, crustáceos y moluscos, se informó que los estrógenos causaban varios efectos negativos principalmente relacionados con la reproducción, como el desarrollo y/o la estimulación de gametos, alteración acciones proteicas, problemas en procesos embrionarios, y otros48,49,50,51,52. Las consecuencias negativas causadas por la contaminación por EE2 ponen de relieve la necesidad de desarrollar enfoques sostenibles para eliminar este compuesto del medio ambiente sin afectar la vida marina.

Paralelamente, con el petróleo que actualmente representa casi el 40% de las fuentes de energía consumidas en el mundo53, la contaminación crónica y los derrames de petróleo a menudo ocurren cerca de las áreas de arrecife11. Se informó que la contaminación por petróleo causa efectos negativos en varias especies de animales marinos, aves, plantas y humanos54,55,56,57. En los corales, causa blanqueo, reduce la resistencia de las larvas al estrés térmico58,interrumpe las comunidades microbianas asociadas21,y causa necrosis tisular. Además, los dispersantes químicos, una técnica de remediación de petróleo comúnmente utilizada por las compañías petroleras para remediar derrames, son aún más tóxicos para los corales que el propio aceite23. Los microorganismos beneficiosos aislados de los corales, en cambio, son conocidos por desempeñar papeles cruciales en la salud del huésped. Sin embargo, la manipulación de estos probióticos potenciales debe ser mejor explorado con el fin de investigar posibles efectos secundarios negativos y las capacidades metabólicas que se pueden analizar para mejorar la aptitud del metaorganismo. En este contexto, características como la actividad antimicrobiana contra los patógenos coralinos, la producción de catalasa para combatir el estrés oxidativo, la capacidad de degradar la urea (que puede tener funciones importantes en el proceso de calcificación) y la presencia de genes que confieren características beneficiosas potenciales, entre otras, deben ser el centro de la investigación. Aquí, mostramos cómo la biorremediación y los probióticos se pueden utilizar para mitigar concomitantemente los impactos de la contaminación y mejorar la salud del coral. El desarrollo de enfoques innovadores que pueden ser utilizados como intervenciones para aumentar la persistencia de las especies marinas representan un paso hacia un planeta más sostenible y saludable.

Protocolo

1. Recolección y almacenamiento de agua y coral para aislamiento microbiano

NOTA: Es esencial tomar las coordenadas y la temperatura de los sitios de muestreo. Si es posible, metadatos como la salinidad, el pH, la profundidad y la intensidad de la luz también pueden ayudar a encontrar enfoques de cultivo ajustados e interpretación futura de los datos. Para obtener resultados fiables, mantenga las muestras almacenadas durante el tiempo mínimo posible. Los microbiomas de agua/coral pueden cambiar considerablemente si las muestras no se mantienen a la temperatura correcta y/o se almacenan durante largos períodos. Si el paso de aislamiento no se realiza al instante después de la recolección, es crucial mantener las muestras a 4 oC hasta el procesamiento. Cuanto más tiempo se almacenen las muestras, incluso a 4oC, más cambiará la comunidad microbiana.

  1. Muestre y almacene agua de mar.
    1. Recoger 500 ml de muestras de agua en al menos triplicado de cada sitio de muestreo objetivo. Utilice preferentemente botellas estériles con tapones de tornillo.
    2. Si procesa el agua al instante después de la recolección, mantenga las botellas en RT durante un breve intervalo. Si el procesamiento de la muestra se está llevando a cabo más tarde, mantenga las botellas a 4 oC.
  2. Muestre y almacene el coral.
    1. Utilice un par estéril de alicates para cortar fragmentos de coral desde el mismo sitio de muestreo de las muestras de agua. Para evitar la contaminación, toque los corales solo con guantes estériles.
    2. Enjuague el fragmento de coral muestreado con una solución salina estéril de 20 ml (3% de NaCl en agua destilada) o agua de mar artificial para deshacerse de las bacterias de vida libre que se unen libremente del agua de mar.
    3. Con fórceps, coloque cada fragmento de coral en un recipiente estéril de 250 a 500 ml con una tapa de tornillo que contenga solución salina estéril.
    4. En el laboratorio, utilizando fórceps y alicates estériles, pesa 5 g de fragmentos de coral utilizando platos estériles de 100 mm x 20 mm de Petri en una báscula de pesaje.
    5. Transfiera los 5 g de muestra de coral a un mortero estéril y maceracon utilizando un pestillo estéril.
    6. Usando una espátula estéril, transfiera la muestra macerada a un matraz de cultivo estéril que contenga 45 ml de solución estéril de 3% NaCl y 10 x 15 perlas de vidrio de 5 mm. Utilice parte de la solución salina estéril de 45 ml para lavar el mortero y recuperar la cantidad máxima de macerato.
    7. Mantenga los matraces bajo agitación constante (150 x g) durante 16 horas a la temperatura del agua del lugar de muestreo.
      NOTA: Para los corales de aguas poco profundas, la temperatura óptima oscilará entre 24 y 28 oC. Este paso separará los microorganismos de diferentes compartimentos de coral, como los que están unidos a las células huésped, o los que viven dentro del tejido y el esqueleto. Después de este paso, los macerados de coral no deben almacenarse, y el paso de aislamiento debe realizarse instantáneamente.

2. Aislamiento de bacterias degradantes EE2 del agua de mar y/o corales

  1. Seleccione bacterias.
    NOTA: Después de los pasos 1.1.2 y 1.2.7, la concentración de microorganismos en el agua de mar que se han separado de los diferentes macerados de coral será desconocida y variable. Para garantizar el aislamiento de colonias microbianas individuales en platos DeLi que contienen medios de agar, se necesitan diluciones en serie.
    1. Realice diluciones en serie de hasta 10-9 en solución salina estéril para muestras de coral y hasta 10-6 para muestras de agua. Las diluciones de pipeta hacia arriba y hacia abajo 5 veces antes de desechar la punta. Muestras de vórtice durante 5 s cada vez antes de realizar la siguiente dilución en serie.
    2. Pipetear 100 l de cada dilución en platos de Petri que contengan un 3% de caldo de glisogenia NaCl (LB) medio de agar, y placarlos.
      NOTA: Utilice el agar marino (MA) como medio alternativo. Se requieren triplicados de cada dilución para obtener resultados fiables.
    3. Incubar las placas durante 1 o 3 días a la temperatura objetivo (p. ej., 26 oC). Revisa los platos una vez al día.
    4. Seleccione y aísle las colonias que presentan distintas morfologías de crecimiento en placas nuevas utilizando la técnica de la placa de rayas. Repita este paso tantas veces como sea necesario para que las colonias puras crezcan en las placas.
    5. Si el procedimiento no continúa en el paso 2.3.1, almacene aislados a 4oC o en glicerol como se describe en la sección 2.2.
  2. Preparar las existencias de glicerol.
    NOTA: Este paso es opcional y se puede utilizar para el almacenamiento de existencias bacterianas a largo plazo.
    1. Recoger colonias individuales de la placa fresca o de las placas almacenadas a 4oC e inocularlas de forma independiente en 2 ml de medio estéril de LB.
    2. Colocar los tubos bajo agitación constante (150 x g)a 24 o 28 oC durante la noche (ON).
    3. Añadir 1 ml de los cultivos bacterianos del paso 2.2.2 y glicerol estéril a una concentración final del 20% a los crioviales de 2 ml.
    4. Dejar los crioviales encendidos a 4oC.
    5. Coloque las reservas bacterianas de glicerol a -80 oC hasta que sea necesario.
  3. Realice la prueba de capacidad de degradación EE2.
    1. Active los aislados en caldo LB o medios alternativos. Para ello, escoge una sola colonia de las placas frescas o la placa almacenada a 4oC, e inocula 2 ml de medio estéril lb. En caso de que sea una culata de glicerol, primero la rasga en placas de agar LB e incuba a 24 o 28 oC ON para que las colonias individuales crezcan. Coloque el tubo que contiene el medio LB inclinado bajo agitación constante (150 x g)a 24 o 28 oC ON.
    2. Después del crecimiento bacteriano, gletar las células centrifugando a 8.000 x g durante 8 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, resuspenda las células en un volumen igual (2 ml) de agua salina para lavar el caldo LB restante.
    3. Repita el paso 2.3.2 dos veces para garantizar que no haya rastros de fuente de carbono, reemplazando las células en un volumen igual de solución salina. Por ejemplo, si se inició con un cultivo de 2 ml, resuspenda las celdas en un volumen final de solución salina de 2 ml.
    4. Inocular las células lavadas y resuspendidas en el medio de cultivo mínimo Bushnell Haas (caldo BH) que contiene EE2 como única fuente de carbono59.
      NOTA: EE2 se disuelve en etanol a una concentración final de 5 mg/L en el medio de cultivo. Realice cambios en el tipo de contaminante y/o concentración si es necesario.
    5. Evaluar el crecimiento bacteriano por densidad óptica a 600 nm y/o colonias formando unidades (CFU) en el agar LB medio33,para 16-72 h de incubación.
      NOTA: Alternativamente, los microorganismos pueden aislarse directamente en medios mínimos que contengan EE2 u otros compuestos, como única fuente de carbono. Este paso dirigiría la selección y evitaría un crecimiento indeseable.

3. Aislamiento de bacterias que degradan el aceite del agua de mar y/o corales

  1. Preparar medios mínimos que contengan una fracción soluble en agua de aceite (oWSF) y una fracción insoluble en agua de aceite (oWIF) como única fuente de carbono21.
    1. Añadir 1-2% de petróleo crudo a 500 ml de agua destilada estéril. Utilice un matraz de filtro abierto en la parte inferior para eliminar la fracción soluble sin perturbar la capa superior de la fracción insoluble.
    2. Mantener la mezcla bajo agitación constante a 24 o28 oC a 150 x g durante 48 h.
    3. Coloque el matraz de filtro que contiene las fracciones de petróleo crudo sobre una superficie estable y espere de 10 a 20 minutos para permitir la separación de fracciones solubles e insolubles.
    4. Transfiera el oWSF a un nuevo matraz estéril, guardando el oWIF abriendo el matraz del filtro inferior y sacando la fracción soluble.
    5. Usando todo el oWSF recuperado en el paso anterior (400 ml), prepare 1 L de agar medio mínimo que contenga oWSF como la única fuente de carbono.
    6. Utilizando el oWIF restante en el matraz del paso 3.1.4, prepare 1 L de medio mínimo de agar BH que contenga oWIF como única fuente de carbono.
  2. Aísle las bacterias que degradan oWSF y oWIF.
    1. Utilizando el agua y el macerar de coral de los pasos 1.1.2 y 1.2.7, respectivamente, diluir las muestras hasta 10-6 en solución salina estéril como se describe en el paso 2.1.1.
    2. Pipetear 100 l de cada dilución en los platos de Petri que contengan medios de agar BH-oWSF y BH-oWIF y placarlos.
    3. Repita los procedimientos descritos desde el paso 2.1.3 al paso 2.1.5.

4. Selección de miembros del consorcio

  1. Extraer y secuenciar el ADN para la identificación taxonómica.
    1. Active los aislados abastectos en glicerol como se describe en el paso 2.3.1.
    2. Extraiga el ADN utilizando un kit de extracción de ADN (ver Tabla de Materiales).
    3. Utilice imprimaciones 27f (5o-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3o) y 1492r (5o-GTT TAC TT GTT ACG ACT T-3o) para la amplificación del gen rRNA 16S.
    4. Realizar reacciones de PCR de 50 ml de acuerdo con el siguiente protocolo: 5 l de tampón de polimerasa 10x, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 5 mM de cada imprimación, 10 ng de ADN genómico y 2,5 U de polimerasa de ADN Taq. Agregue controles negativos (es decir, extracciones de ADN en blanco y reacciones de PCR sin ADN de plantilla) para garantizar que no haya contaminación.
    5. Configurar los siguientes pasos de ciclo térmico: un primer ciclo de desnaturalización a 94 oC durante 4 min; 35 ciclos a 94oC durante 1 min, seguidos de 50oC durante 1 min y 72oC durante 2,5 min; un ciclo de extensión final durante 10 min a 72 oC.
    6. Compruebe la integridad del amplicon en un gel de agarosa del 1,2% con 80 V.
    7. Purificar las muestras utilizando un kit de purificación de gel (ver Tabla de Materiales).
    8. Cuantifique los productos PCR utilizando un fluorómetro.
    9. Enviar producto para la secuenciación.
      NOTA: Para obtener mejores clasificaciones taxonómicas, se recomienda el método Sanger60,ya que proporciona secuencias largas. Las imprimaciones universales 27f y 1492r se pueden utilizar para amplificar casi toda la longitud del gen 16S rRNA61. Si los contigs no se pueden ensamblar con un par de imprimadores, se debe considerar un par adicional en el medio de la secuencia.
  2. Determine la curva de crecimiento.
    1. Active los aislados en las existencias de glicerol del paso 2.2.5 como se describe en el paso 2.3.1 pero utilizando 5 ml en lugar de 2 ml.
    2. Añadir el 1% (v/v) del cultivo de 5 ml cultivado desde el paso 4.2.1 en triplicados, a un matraz de 250 ml que contenga 100 ml de 3% de medios LB. Asegúrese de preparar los triplicados de un control negativo (sin inóculo) también.
    3. Colocar los matraces en una incubadora bajo agitación constante (150 x g)a 24 o28 oC.
    4. Tomar 1 mL alícuotas cada 4 h durante 48 h. Si las cepas presentan una alta tasa de crecimiento, disminuya el intervalo de 4 h.
    5. Mida la estimación de densidad óptica (OD) a 600 nm de longitud de onda y unidades formadoras de colonias (CFU) contadas a partir de diluciones en serie chapadas en placas de medios enriquecidos (100 l se deben inocular en cada placa y normalizarse al volumen de 1 ml).
    6. Trazar las curvas OD y CFU y analizar la correlación de OD/CFU de cada deformación unitaria individual. A partir de ahora, calcule el número de celdas en función de los valores de OD.
  3. Realice una prueba de antagonismo.
    1. Active los aislados como se describe en el paso 2.3.1.
    2. Inocular una cepa a la vez a lo largo de la mitad de las placas que contienen medios de agar y las otras perpendiculares a la central. Repita el proceso hasta que cada cepa microbiana seleccionada se pruebe contra todas las demás.
    3. Incubar las placas a 24 o28 oC y controlarlas diariamente para observar posibles halos que indiquen actividad antagónica. Si se observan halos que indican actividad antagónica entre dos cepas, se debe excluir una de ellas.
  4. Realizar el ensamblaje del consorcio.
    1. Active los aislados como se describe en el paso 2.3.1.
    2. Peletizar las células a 3.500 x g y lavarlas suavemente 2 veces en un volumen igual de solución salina. Resuspenda las células en un volumen igual (es decir, si el volumen final fue de 2 ml de células, lávelas con 2 ml de solución salina y resuspenderlas en un volumen final de 2 ml).
    3. Inocular 1 ml de cultivo en 100 ml 3% NaCl LB medio e incubar ON a 150 x g.
    4. Repita el paso 4.5.2, inocular los cultivos cultivados, lavados y resuspendidos de 100 ml en cultivos de 10 L. Incubar ON en biorreactores de elevación de aire estériles, recibiendo aire filtrado de una bomba. Si se necesita más cultura, siempre inocular el 1% de la cultura cultivada en medios frescos.
    5. Centrifugar cultivos cultivados a 8.000 x g durante 8 min a 4oC. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación.
    6. Lavar el pellet, reemplazando suavemente las células en 500 ml de solución salina estéril.
    7. Repita los pasos 4.5.5 y 4.5.6.
    8. Resuspenda cada cultivo individual en 100 ml de solución salina y mida la DO para estimar el número de celdas.
    9. Calcular el volumen de cada cultivo necesario para alcanzar una concentración final de 107 celdas mL-1.
    10. Realizar CFU cuenta con medios enriquecidos para una confirmación final de la viabilidad celular y la concentración.
    11. Mezclar un volumen igual de cada cultivo individual en matraces estériles y alícuota al consorcio en tubos estériles de 50 ml.
    12. Mantener a 4oC hasta la inoculación.
      NOTA: Prepare el conjunto del consorcio lo más fresco posible para garantizar que las celdas seguirán siendo viables. Alternativamente, los recuentos de UFC se pueden realizar antes de la inoculación. Para ensamblar un consorcio ideal, es necesario utilizar aislados que presenten capacidades metabólicas diferentes y complementarias. Por lo general, 6 a 10 aislados se utilizan para formar consorcios, pero este número variará dependiendo de las características y propósitos de los miembros.

5. Detección de características beneficiosas putativas para corales

  1. Activar los aislados de las poblaciones de glicerol rayándolos en placas de agar LB e incubando a 24-28 oC ON para que las colonias individuales crezcan. Escoge una sola colonia de las placas e inocula en 2 ml de medio estéril LB. Coloque el tubo que contenga un medio LB inclinado bajo agitación constante (150 x g)a 24 o 28 oC ON.
  2. Realizar la extracción de ADN como se describe en la sección 4.1 para la detección de genes potencialmente beneficiosos por PCR.
    NOTA: Las condiciones de reacción y los imprimadores de la PCR dependerán del gen objetivo. En la Tabla 1se describen metodologías para probar las características de BMC de cepas individuales y detección de PCR en busca de genes potencialmente beneficiosos.

Resultados

Sobre la base de los métodos descritos aquí, fue posible aislar microorganismos de diferentes fuentes de agua y nubbins de coral que presentan características de BMC putativas y capaces de degradar diferentes clases de contaminantes(Figura 1). Utilizando muestras de agua recogidas en una planta de tratamiento de aguas residuales, obtenidas de CESA-UFRJ (Centro Experimental de Saneamiento Ambiental de la Universidad Federal de Río de Janeiro), y en base al procedimiento presentado aquí, 33 cepas bacterianas capaces de degradar EE2 en se aisló una concentración final de 5mg/L(Figura 2A). Además, utilizando la técnica para seleccionar bacterias que degradan el aceite, se aislaron 20 cepas capaces de degradar tanto oWSF(Figura 2B)como oWIF(Figura 2C).

Las características de BMC putativas fueron examinadas en microorganismos aislados de diferentes especies de coral bajo diversas condiciones. Entre ellos, una cepa que presenta una fuerte actividad antagónica contra el patógeno coralino Vibrio coralliilyticus (Figura 3A),cepas capaces de degradar la urea(Figura 3B),un buen productor de catalasa(Figura 3 C), y se encontraron microorganismos que presentaban genes potencialmente beneficiosos(Figura 3D).

Empleando los dos enfoques combinados (es decir, la biorremediación y la inoculación de BMC), fue posible proteger a los corales de los impactos de la exposición al petróleo. Para ello, un consorcio de biormediador de petróleo pBMC, aislado del coral Mussismilia harttii,fue inoculado en nubbins de coral expuestos al 1% de aceite en triplicados21. Los tratamientos expuestos al aceite presentaron una disminución progresiva de Fv/Fm a partir del cuarto día, alcanzando valores cercanos a cero para el décimo día. La fluorescencia variable/fluorescencia máxima (Fv/Fm) proporcionó una medida de la máxima eficiencia fotoquímica del fotosistema II (PSII) de las zooxanthellae, lo que representa una medición indirecta de la salud del coral. Por otro lado, los nubbins de coral presentes en los acuarios inoculados con el consorcio mostraron una capacidad fotoquímica mejor conservada(Figura 4).

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Figura 1: Resumen de los pasos principales de la selección y montaje del consorcio bioremediator-pBMC. Esquema de pasos de selección de microorganismos degradantes de contaminantes (en gris) y pasos finales utilizados para la selección microbiana del consorcio (secuenciación de ADN, curva de crecimiento, prueba de antagonismo y ensamblaje del consorcio en rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Selección de bacterias que degradan los contaminantes. (A) Los aislados bacterianos crecen en placas de medios mínimos que contienen EE2 como única fuente de carbono. (B) Colonias de bacterias que crecen en placas de medios mínimos que contienen oWSF como única fuente de carbono. (C) Colonias de bacterias que crecen en placas de medios mínimos que contienen oWIF como única fuente de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Detección de características pBMC. (A) Manchas en triplicados de cepa que presentan actividad antagónica contra el patógeno coralino Vibrio coralliilyticus (en negro) y una cepa de control (en verde). (B) Cepas que crecen en medios que contienen urea como única fuente de carbono. (C) Cola producir catalasa (+) y una cepa de productor de catalasa mala (-). (D) Ejemplo de detección de PCR del gen nirK (carril 1 a escalera de 1 kb; carril 2 - control negativo de extracción de ADN en blanco; detección de carril 3 a nirK; carril 4 - reacciones de PCR sin ADN de plantilla). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Mediciones Fv/Fm de M. harttii nubbins de adaptación oscura a las 5 PM, utilizando un fluorómetro de clorofila de pam de buceo. Las mediciones Fv/Fm del consorcio de control de tratamientos, el petróleo y el aceite con consorcio se realizaron en triplicados todos los días durante 10 días. Se muestra la desviación estándar. Las características del gráfico se modificaron con el permiso de los resultados anteriores21,disponible según https://www.nature.com/articles/srep18268 en un Creative Commons Attribution 4.0. Términos completos en http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

MoaMicroorganismoTécnica de detecciónReferencias
Regulación climática; surfur ciclismo; compuestos antimicrobianos; aumentar la protección antioxidante de las células.Aspergillus sydowiiPCR para el gen dddP81
Pseudovibrio sp. P12Medio de cultivo con DMSP82
Pseudoalteromonas sp.PCR para el gen dmdA33
Regulación biológica de patógenos.Microbioma de Acropora palmata mucusZona clara de inhibición83
Extractos de coralesEnsayo de inhibición del crecimiento84
Marinobacter sp.Ensayos de enjambre85
Pseudoalteromonas sp.Agar placa de rayas cruzadas86
Pseudoalteromonas sp.Método de difusión de agar33
Beneficio para el proceso de calcificación; fuente de nitrógeno para los corales escleractinianos.Simbiondodinio spp.Método colorimétrico87
Microbioma de Stylophora pistillata mucus___88
Microbioma de Acropora alciminataMétodo de Bolland et al.8089
Ciclo de nitrógeno; aumentar la fijación de nitrógeno.Comunidad microbianaQpcr90
Comunidad microbianaPcr91
Comunidad microbianaQpcr92
Comunidad microbianaTécnica de reducción de acetileno adaptado (C2H2)93
Pseudoalteromonas sp. y Halomonas taeanensisPcr33
Ciclo de nitrógeno; disminución de la concentración de amonio.Pseudoalteromonas sp.Pcr33
Microbioma de Tubastraea coccineaPcr94
Microbioma de Xestospongia testudinariaAnálisis predictivo del metrógeno95
Protección holobiónta contra especies reactivas de oxígeno (ROS).Pseudoalteromonas sp., Cobetia marina y Halomonas taeanensisPrueba de catalasa33
Simbiondodinio spp.Rojo amplex96
Vibrio pelagius y Sync- chococcus sp.Método de peroxidasa-escopoletina de rábano picante97
Vibrio fischeriMúltiples métodos98

Tabla 1: Detección de características putativas de BMC, mecanismo de acción (MOA), microorganismos notificados que presentan el potencial y la técnica utilizada para detectar la característica.

Discusión

Los enfoques de la biorremediación se han explorado masivamente en los últimos 50 años. Por ejemplo, más de 200 microbios entre bacterias, cianobacterias, microalgas y hongos en varios hábitats diferentes, han sido designados como capaces de indicar la presencia y/o degradación de hidrocarburos petroleros62,63,64 . Además, otras clases de compuestos que causan impactos al medio ambiente y a los seres humanos, como el plástico, el bisfenol A, los disruptores endocrinos y los metales pesados, son objetivos para el desarrollo de la técnica de biorremediación65,66, 67. Por otro lado, el desarrollo de probióticos marinos se ha limitado a los campos que tienen un impacto obvio en la economía, como los probióticos de pescado en la acuicultura68,69. Sin embargo, el aislamiento y caracterización de microorganismos beneficiosos para proteger los arrecifes de coral, los ecosistemas marinos que apoyan la pesca, el turismo y otras actividades rentables, están empezando a ser valorados15. Aquí, un protocolo barato, fácil y accesible para seleccionar microorganismos degradantes de contaminantes que también pueden presentar características potencialmente beneficiosas para los ecosistemas marinos locales, especialmente los microorganismos beneficiosos putativos para los corales (pBMC), es Descrito.

Además, el método demostrado aquí es altamente adaptable a varios compuestos y diversos tipos de fuentes microbianas. Es posible atacar diferentes contaminantes reemplazando la única fuente de carbono añadida al medio mínimo. Para ello, en lugar de aceite o EE2, se deben añadir otros compuestos a la concentración deseada. Esta sería la presión selectiva para aislar a los degradantes de los contaminantes específicos. Por ejemplo, los microorganismos capaces de degradar otras clases de disruptores endocrinos ya han sido seleccionados y probados utilizando la misma metodología70. Además, otros organismos marinos y terrestres, como esponjas y plantas71,72, así como distintos tipos de muestras ambientales, como el suelo, el combustible y las rocas, pueden utilizarse como fuentes degradantes-microbianas25, 73,74. Por ejemplo, fue posible detectar y aislar bacterias degradantes de hidrocarburos de diferentes muestras de suelo y sedimentos25,54,63,64,75. Por último, realizando ligeras modificaciones en los medios, los microorganismos distintos de las bacterias se pueden seleccionar fácilmente como los microbios degradantes. Por ejemplo, una cepa de microalgas con la capacidad de degradar eficientemente los compuestos de estrógeno se ha reportado76.

Idealmente, consorcios bioremediación-probiótico deben ser ensamblados para cada compuesto o área específica. Los microbios que crecen en un entorno específico pueden no crecer tan bien en nuevos sitios en comparación con sus condiciones nativas. Debido a que los investigadores no han encontrado un producto que pueda ser aplicado eficientemente bajo todas las condiciones ambientales diferentes, se debe realizar un nuevo conjunto de consorcios para cada situación específica. Esto sería similar a la medicina personalizada para la recuperación adaptada al medio ambiente. Por esta razón, la creación de un banco central de cepas microbianas con características probióticas potenciales y capacidad de degradación es un paso crucial para el progreso de este campo. Esta iniciativa ahorraría tiempo y trabajo, contribuyendo a la reunión de nuevos consorcios específicos en todo el mundo.

Los microorganismos asociados con los corales (es decir, microalgas, bacterias, arqueas, hongos y virus) tienen un papel complejo e intrincado en el mantenimiento de la homeostasishuésped 19. Los factores estresantes ambientales, como la contaminación, también pueden desestabilizar el microbioma coralino, lo que resulta en disbiosis, que puede causar enfermedades y mortalidad30. Los mecanismos por los cuales el microbioma coralino puede apoyar la salud del coral están empezando a ser revelados. Estos mecanismos son la clave para entender la resistencia y la resiliencia de los corales a los factores estresantes ambientales y, en consecuencia, para promover la persistencia y la preservación de los arrecifes. Además, los hallazgos en el campo ayudarán a entender las interacciones generales huésped-microbioma, que pueden contribuir al desarrollo de mejores probióticos y estrategias de promoción de la salud en otras áreas. También es importante investigar mejor cómo estas inoculaciones de probióticos pueden interferir en la salud del metaorganismo durante eventos de estrés. Por ejemplo, trabajo que muestra que el aumento en el rendimiento de coral se debe a los probióticos y no simplemente el coral que utiliza bacterias como fuente de alimento todavía se necesitan.

Paralelamente, el desarrollo de nuevos enfoques de entrega de consorcios y la mejora de los existentes son de gran importancia. Los métodos alternativos para la inmovilización del consorcio, así como los enfoques innovadores, como la inoculación de alimentos coralinos (es decir, artemia y rotíferos) y su uso como vectores, son prometedores. Estos sistemas de entrega también se pueden modificar para apuntar a otros organismos marinos y será esencial para el éxito del campo de probióticos marinos.

La mitigación de la contaminación y la persistencia de los arrecifes de coral son actualmente dos de los principales temas destacados en las conferencias ambientales con regularidad. La Agenda 2030, un documento publicado por las Naciones Unidas que describe los objetivos mundiales que la sociedad debe alcanzar para permitir un futuro sostenible, dedica metas específicas para cada tema. Si bien el Objetivo 6 destaca la importancia de la mejora de la calidad del agua mediante la reducción de la contaminación, el Objetivo 14 refuerza la pertinencia de la conservación y el uso sostenible de los océanos, los mares y los recursos marinos77. En este contexto, la conservación de los arrecifes de coral depende de los cambios que deben lograrse en un futuro próximo, incluida la mitigación de la contaminación. Esto es de gran importancia, porque la mayoría de las pérdidas masivas de coral ocurrieron cuando se añadieron otros factores a los eventos climáticos, como la destrucción y contaminación del hábitat local78,79. Este documento demostró que es posible combinar la biorremediación y la inoculación de pBMC para degradar contaminantes específicos, mientras que puede aumentar la resistencia y resistencia del coral para hacer frente a los contaminantes y otros problemas. La optimización de los protocolos existentes y/o el desarrollo de métodos innovadores, combinados o aplicados de forma independiente, serán cruciales para determinar el futuro de los ecosistemas marinos.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación se llevó a cabo en asociación con el proyecto de I+D en curso registrado como ANP 21005-4, "PROBIO-DEEP - Encuesta de posibles impactos causados por la exploración de petróleo y gas en holobiantes marinos de aguas profundas y selección de bioindicadores potenciales y procesos de biorremediación para estos ecosistemas" (UFRJ / Shell Brasil / ANP) – "PROBIO-DEEP - Levantamento de potenciais impactos causados pela explorao de óleo e gás em holobiontes marinhos em mar e sele-o deis potencia bioindicadores e processos biorremediadores para esses ecossistemas", patrocinado por Shell Brasil bajo el gravamen de I+D de la ANP como "Compromisso de Investimentos com Pesquisa e Desenmenmenvolvito. Los autores también agradecen al Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico y Tecnológico (CNPq) y a la Coordenao de Aperfei-oamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) por su apoyo financiero, y a Camila Messias, Phillipe Rosado y Henrique Fragoso dos Santos, para las imágenes proporcionadas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Botella de almacenamiento de medios PYREX de 500 mLthomas scientific/Corning1743E20/1395-500Se utiliza para tomar muestras de agua.
Botellas aspiradoras de 500 mLthomas scientific/Corning1234B28/1220-2XSe utilizan para separar las fracciones de aceite.
Alicate para cortar alambre de 6 pulgadasthomas scientific/Restek1173Y64/23033Se utiliza para cortar fragmentos de coral.
17a-EtinilestradiolLGC NormasDRE-C13245100Se utiliza como única fuente de carbono para fabricar los medios selectivos.
AgarHimediaPCT0901-1KGSe utiliza para fabricar medios sólidos.
Caldo Bushnell HaasHimediaM350-500GSe utiliza como medio mínimo para ser complementado con fuentes de carbono.
Frasco Erlenmeyerthomas scientific/DWK Life Sciences (Kimble)4882H35/26500-125Se utiliza para incubar macerado de coral con perlas de vidrio.
Kit de purificación de banda de gel y ADN GFX PCR GEHealthcare28903470Se utiliza para purificar productos de PCR antes de enviarlos para su secuenciación.
Perlasde vidrio MP Biomedicals1177Q81/07DP1070Se utiliza para separar los microorganismos de las estructuras de coral.
flujo laminarnecesaria para trabajar en condiciones estériles.
Caldo Luria Bertani, Miller (Caldo Miller Luria Bertani)HimediaM1245-1KGSe utiliza como medio rico para cultivar bacterias.
Agar marino 2216 (Agar marino Zobell)HimediaM384-500GSe utiliza como medio rico para cultivar bacterias.
de agitación orbitalSe utiliza para incubar medios líquidos y aceite.
IncubadoraSe utiliza para incubar placas.
Mortero de porcelanaThomas scientific/United Scientific Supplies1201U69/JMD150Se utiliza para macerar fragmentos de coral.
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenSe utiliza para la cuantificación de ácidos nucleicos de ADN y productos de PCR.
CentrífugaSe utiliza para centrifugar cultivos bacterianos.
EspectrofotómetroSe utiliza para medir la densidad óptica de cultivos bacterianos.
Wizard Kit de purificación de ADN genómicoPromegaA1120Se utiliza para la extracción de ADN de cepas microbianas.
Campana de Incubadora de placas refrigerada

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