Artículo de método

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

DOI:

10.3791/60242

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17 de septiembre de 2019

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1Department of Genetics, University of Pennsylvania, 2Department of Medicine, University of Pennsylvania

En este artículo

Resumen

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La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Resumen

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La repoblación hepática después de una lesión es una característica crucial de los mamíferos que evita la falla inmediata de los órganos y la muerte después de la exposición de toxinas ambientales. Una comprensión más profunda de los cambios en la expresión génica que se producen durante la repoblación podría ayudar a identificar dianas terapéuticas para promover la restauración de la función hepática en el entorno de lesiones. Sin embargo, los métodos para aislar específicamente los hepatocitos repobladores se ven inhibidos por la falta de marcadores celulares, números celulares limitados y la fragilidad de estas células. El desarrollo de la tecnología de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) en conjunto con el modelo de ratón Fah-/- para recapitular la repoblación en el entorno de la lesión hepática permite el perfil de expresión génica de la repoblación Hepatocitos. Con TRAP, el ARNm de traducción específico del tipo de celda se aísla rápida y eficientemente. Desarrollamos un método que utiliza TRAP con aislamiento basado en afinidad de traducir mRNA de hepatocitos que expresan selectivamente la proteína fluorescente verde (GFP) con etiqueta de proteína ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP elude el largo período de tiempo requerido para la clasificación celular activada por fluorescencia que podría cambiar el perfil de expresión génica. Además, dado que sólo los hepatocitos repobladores expresan la proteína de fusión GFP:RPL10A, el ARNm aislado está desprovisto de contaminación de los hepatocitos heridos circundantes y otros tipos de células en el hígado. El ARNm purificado por afinidad es de alta calidad y permite el análisis basado en la secuenciación descendente de PCR o de alto rendimiento de la expresión génica.

Introducción

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Como el principal órgano metabólico en vertebrados, el hígado es responsable de la homeostasis de glucosa, síntesis de proteínas séricas, secreción de ácido biliar, y metabolismo xenobiótico y desintoxicación. El hígado posee una capacidad extraordinaria para regenerar el parénquima lesionado al exponerse a toxinas para prevenir la insuficiencia hepática inmediata1. Sin embargo, el fracaso de la regeneración puede ocurrir en el entorno de paracetamol o consumo excesivo de alcohol, que puede conducir a insuficiencia hepática aguda2. Además, la lesión hepática crónica causada por la infección por hepatitis viral, la enferm....

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Protocolo

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Todos los métodos que implican el uso de ratones son consistentes con las pautas proporcionadas por la IACUC de la Oficina Penn de Bienestar Animal de la Universidad de Pensilvania.

1. Preparación de reactivos

  1. Cicloheximida
    1. Para hacer 500 ml de 0,1 g/mL de cicloheximida, suspenda 50 mg de cicloheximida en 500 ml de metanol.
      PRECAUCION: La cicloheximida es extremadamente tóxica para el medio ambiente y puede causar malformación congénita. Todos los desechos y tampones que contengan cicloheximida deben recogerse para su eliminación adecuada.
      NOTA: La cicloheximida s....

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Resultados

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Para perfilar la expresión génica en la repoblación de hepatocitos del ratón Fah-/-, la fusión Gfp:Rpl10a y los transgenes de Fah se entregan conjuntamente dentro de un plásmido que contiene transposón8 (vector TRAP) a los hígados por inyección hidrodinámica(Figura 1A). La eliminación de la nitisinona induce una lesión hepática tóxica que crea una presión de selección para los hepa.......

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Discusión

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TRAP-seq es una técnica para el aislamiento específico del tipo de celda de la traducción de ARNm a través de ribosomas etiquetados con epítopos y presenta una alternativa a los enfoques FACS, ya que elude limitaciones como los requisitos de tiempo de FACS9. En su lugar, TRAP permite el aislamiento rápido y eficiente del ARN directamente de los tejidos a granel, ayudando a evitar cualquier alteración en la expresión génica. TRAP-seq es especialmente adecuado para su uso en el repoblado hígado de r.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) y P30-DK050306 (Subvención piloto a KJW).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Molinillo de pañuelos de 10 mL, Potter-Elv, recubiertoDWK Life Sciences (Wheaton)358007
Absolutely RNA Miniprep KitAgilent400800
Anti-GFP AnticuerpoMemorial Sloan-Kettering & Bioresource CoreGFP Ab #19C8 y GFP Ab #19F7
Albúmina sérica bovina, libre de IgG, libre de proteasaJackson ImmunoResearch001-000-162
cOmplete, Mini, sin EDTA Cóctel de inhibidores de proteasaRoche11836170001
CicloheximidaMillipore SigmaC7698
Ácido desoxicólico, DOCMillipore SigmaD2510
D-glucosa, dextrosaFisher ScientificD16
DL-ditiotritolMillipore SigmaD9779
Dynabeads MyOne Estreptavidina T1Thermo Fisher Scientific65602
Fisherbrand Placas de Petri con tapa transparenteFisher ScientificFB0875712
HBSS (10x), calcio, magnesio, rojo sin fenolThermo Fisher Scientific14065-056
HEPES, solución 1 M, pH 7,3, grado de biología molecular, ultrapuro, Thermo ScientificThermo Fisher ScientificAAJ16924AE Cloruro
de magnesio, MgCl2 Millipore SigmaM8266
MetanolFisher ScientificA452
NanoDrop 2000/2000c EspectrofotómetroThermo Fisher ScientificVV-83061-00
NEBNext Módulo de aislamiento magnético de ARNm Poly(A)New England BioLabsE7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit para IlluminaNew England BioLabsE7530S
Nonilfenil polietilenglicol, NP-40. IGEPAL CA-630Millipore SigmaI8896
Agua sin nucleasas, no tratada con DEPCAgitador aéreo AmbionAM9932
DWK Life Sciences (Wheaton)903475
Tampón PBS (10x), pH 7.4AmbionAM9625
Pierce Proteína L recombinante, BiotiniladaThermo Fisher Scientific29997
Cloruro de potasio, KClMillipore SigmaP4504
RNA 6000 Pico Kit & ReactivosAgilent5067-1513
RNaseZap Solución de descontaminación de ARNasaInvitrogenAM9780
Inhibidores de la RNasina ribonucleasaPromegaN2515
Azida sódica, NaN3Millipore SigmaS2002
Bicarbonato de sodio, NaHCO3Millipore SigmaS6297
SUPERase· En inhibidor de ARNasaInvitrogenAM2694

Referencias

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  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R.

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Etiquetas

Translating Ribosome Affinity PurificationTRAP seqHepatocyte IsolationLiver RepopulationGFP L10A Fusion ProteinMagnetic Bead IsolationNuclear Lysate PreparationRNA Cleanup ProtocolHigh throughput Sequencing

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