Pantalla de péptido sinábicos para la selección de nuevas enzimas biotinylantantes

Resumen

Aquí presentamos un método para seleccionar nuevas variantes de la E. coli biotin-protein ligase BirA que biotinyla un péptido objetivo específico. El protocolo describe la construcción de un plásmido para la visualización bacteriana del péptido objetivo, la generación de una biblioteca BirA, la selección y caracterización de variantes BirA.

Resumen

La biotina es una atractiva modificación post-traduccional de proteínas que proporciona una potente etiqueta para el aislamiento y detección de proteínas. La biotinylación enzimática por la E. coli biotin-protein ligase BirA es muy específica y permite la biotinylación de proteínas diana en su entorno nativo; sin embargo, el uso actual de biotinilación mediada por BirA requiere la presencia de un péptido aceptador sintético (AP) en la proteína diana. Por lo tanto, su aplicación se limita a las proteínas que han sido diseñadas para contener el AP. El propósito del presente protocolo es utilizar la visualización bacteriana de un péptido derivado de una proteína diana no modificada para seleccionar las variantes de BirA que biotinylates el péptido. El sistema se basa en un único plásmido que permite la co-expresión de variantes BirA junto con un andamio para la visualización de péptidos en la superficie bacteriana. El protocolo describe un procedimiento detallado para la incorporación del péptido objetivo en el andamio de la pantalla, la creación de la biblioteca BirA, la selección de variantes de BirA activas y la caracterización inicial de las variantes aisladas de BirA. El método proporciona un sistema de selección altamente eficaz para el aislamiento de nuevas variantes BirA que se pueden utilizar para la evolución más dirigida de ligasas biotina-proteína que biotinylan una proteína nativa en soluciones complejas.

Introducción

La biotinylación de una proteína crea una etiqueta poderosa para su aislamiento y detección de afinidad. La biotinylación de proteínas enzimáticas es una modificación post-traduccional altamente específica catalizada por ligasas de biotina y proteína. La E. coli biotin-protein ligase BirA es extremadamente específica y covalentemente biotinyla sólo un número restringido de proteínas de origen natural en residuos específicos de lisina¹. Las ventajas de la biotinilación catalizada por BirA se aprovechan actualmente fusionando la proteína diana con un pequeño péptido sintético de 15 aminoácidos que acepta la biotina (AP) que se biotintiza eficazmente² y permite el altamente específico y biotinylación eficiente in vivo e in vitro por coexpresión o adición de BirA^3,4,5. Aunque la ligadura biotina-proteína catalizada in vivo e in vitro de BirA es una estrategia de etiquetado atractiva, su aplicación se limita a muestras que contienen proteínas fusionadas con AP. El propósito de este método es el desarrollo de nuevos mutantes de ligasas biotina-proteína que biotinylan selectivamente proteínas nativas no modificadas y, de este modo, ampliar el número de aplicaciones en las que se puede utilizar la estrategia de biotintinación enzimática.

La función proteica se puede evolucionar a través de rondas iterativas de la mutación genética, selección y amplificación de variantes genéticas con la función deseada. Una estrategia de selección fuerte y eficiente es crucial para la evolución dirigida y la actividad de la ligasa de proteína sin biotina se selecciona fácilmente debido a la fuerte unión entre la biotina y la estreptavidina y sus homólogos^6. Las tecnologías de visualización de Phage permiten la selección de fagos que muestran péptidos biotinilados^7,8. Dado que la amplificación de fagos aislados requiere la infección de un huésped bacteriano, sin embargo, la selección del fago con estreptavidina crea un cuello de botella en el que la unión de alta afinidad de biotina a la estreptavidina es prácticamente irreversible bajo la no desnaturalización Condiciones. Para garantizar la unión reversible de fagos biotinilados, se utilizaron ávidinas monoméricas con menor afinidad que dieron lugar a un modesto enriquecimiento de¹⁰veces 7 . Recientemente hemos desarrollado un método de visualización bacteriana para el aislamiento de nuevas variantes BirA que elimina la necesidad de la elución de la matriz de afinidad y por lo que elimina un cuello de botella de los sistemas de selección BirA anteriores⁹. De hecho, nuestro sistema de visualización bacteriana permite un enriquecimiento de 1.000.000 de clones activos en un solo paso de selección^9,proporcionando así un sistema de selección eficaz para la evolución dirigida de las nuevas variantes BirA.

Nuestro sistema de visualización bacteriana consta de dos componentes, BirA con una etiqueta C-terminal 6xHis y una proteína de andamio que permite la visualización superficial de un péptido objetivo. Utilizamos la proteína andamio mejorada circularmente permutada proteína de membrana externa X (eCPX) ya que la visualización efectiva de péptidos se puede observar tanto en el N- y C-termini^10,11. La fusión de la secuencia de péptidos diana con el Término C de eCPX asegura la biotinilación de bacterias que expresan variantes activas de BirA. Las bacterias permiten la selección efectiva de la estreptavidina, ya que el péptido biotintilado ahora se muestra en la superficie(Figura 1a).

El propósito de este método es seleccionar para nuevas variantes de BirA que biotinylates secuencias de péptidos presentes en proteínas nativas. El sistema está codificado por genes presentes en el plásmido pBAD-BirA-eCPX-AP, que contiene un promotor inducible de arabinosa que controla BirA (araBAD), y un promotor T7 que controla eCPX⁹ (Figura 1b). El presente protocolo describe el procedimiento detallado para 1) la incorporación de un péptido derivado de una proteína diana en el terminal C de eCPX, 2) la creación de una biblioteca mutacional de BirA mediante PCR propensa a errores, 3) selección de bacterias de unión a la estreptavidina por clasificación celular activada magnéticamente (MACS), 4) cuantificación del enriquecimiento de bacterias y 5) caracterización inicial de clones aislados.

Protocolo

1. Inserción de la secuencia de secuenciación de codificación de péptidos en pBAD BirA-eCPX-AP

NOTA: Para seleccionar las variantes de BirA que biotinylan una proteína diana nativa, comience por identificar una secuencia de péptidos de 15 aminoácidos en la secuencia primaria de proteínas que contiene al menos un residuo de lisina (K).

1. Vaya a la suite de manipulación de^{secuencias 12}.
2. Pegue la secuencia de péptidos de aminoácidos identificada de 15 en la caja de entrada en formato FASTA y pulse Enviar.
3. Seleccione y copie la traducción inversa de 45 nucleótidos de la secuencia de péptidos.
4. Descargue el archivo GenBank para pBAD-BirA-eCPX-AP desde http://n2t.net/addgene:121907.
5. Cargue el archivo en un editor de plásmidos (por ejemplo, ApE) y, en la ventana de características, seleccione la secuencia AP designada "AviTag(TM)".
6. Haga clic con el botón derecho en la secuencia DE AP resaltada en la ventana de secuencia de ADN y seleccione Pegar Rev-Com en el menú contextual.
   NOTA: La secuencia de codificación de eCPX está en la dirección inversa y la secuencia de codificación de péptidos debe, por lo tanto, pegarse como un complemento inverso.
7. Haga clic con el botón derecho en la secuencia resaltada y seleccione Nueva función.
8. Agregue un nombre descriptivo de la secuencia insertada y pulse OK.
9. Seleccione Guardar como en el menú Archivo para guardar el archivo modificado.
10. Diseñar la imprimación delantera para incluir los últimos 30 nucleótidos del complemento inverso de la secuencia de codificación de péptidos y añadir la secuencia de nucleótidos de unión plásmido (3'-GCGGCCGCCTGC-5') a su extremo de 5').
11. Diseñar la imprimación inversa para incluir los primeros 30 nucleótidos del complemento inverso de la secuencia de codificación de péptidos y añadir la secuencia de nucleótidos de unión plásmido (3'- CTTAAGTAATGTTTAAACGAATTCGAG-5') a su extremo de 5').
12. Configure una reacción de PCR de 20 l en un tubo de PCR de paredes delgadas añadiendo los reactivos enumerados en la Tabla 1.
13. Transfiera el tubo a un ciclor térmico y realice la PCR utilizando un programa con una desnaturalización inicial a 98 oC durante 30 s, 30 ciclos de [15 s a 98 oC, 15 s a 60 oC y 3 min a 72 oC], extensión final durante 2 min a 72 oC y mantener a 4 oC.
14. Ejecutar 5 l de la reacción de PCR en un gel de agarosa del 1% para confirmar la amplificación de un producto PCR de 6 kb.
    NOTA: Si no se observa ningún producto PCR, optimice la condición de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El protocolo se puede pausar aquí.
15. Añadir 1 l de DpnI a la reacción de PCR e incubar durante 1 h a 37 oC
16. Transforme el E. coli competente con 2 l de reacción de PCR digerida dpnI y placa en caldo lysogénico (LB)/placas de amperio. Incubar durante la noche a 37oC.
17. Inocular 5 ml de LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con una sola colonia. Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 200 rpm.
    NOTA: Se recomienda probar al menos 6 colonias.
18. Hacer poblaciones de congelación de 850 l de cada cultivo nocturno añadiendo glicerol a una concentración final del 15% al cultivo. Conservar a -80oC.
19. Extraiga el ADN plásmido del cultivo restante de 4 ml mediante un kit de extracción de ADN mini-preparación.
20. Confirmar la correcta inserción de la secuencia de codificación de péptidos mediante secuenciación de ADN utilizando la imprimación de terminal T7 (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).

2. Generación de una Biblioteca BirA

NOTA: La biblioteca mutacional inicial de BirA(Figura 1c, paso 1) es creada por PCR propensa a errores. Es probable que otros métodos para generar la biblioteca mutacional de BirA también funcionen.

1. Sintetizar los megaprimers mutantes con BirA-6xHis hacia adelante (ATAGAGGATAACACCGTGCC) y inverso (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) imprimaciones usando 1 ng de pBAD-BirA-eCPX con la secuencia de péptidos objetivo (preparado y confirmado en el paso 1.20) como plantilla y 35 ciclos de PCR con una temperatura de recocido de 60 oC según las instrucciones del fabricante.
2. Ejecutar 5 l de la reacción de amplificación en un gel de agarosa del 1% para verificar la amplificación de un producto PCR de 984 bp.
3. Purificar el producto PCR de los 45 s l restantes de la reacción de amplificación utilizando un kit de purificación de PCR comercial y utilice un espectrofotómetro para cuantificar el rendimiento del ADN.
   NOTA: La purificación a partir de una sola reacción de amplificación de 45 s generalmente produce un rendimiento suficiente (>250 ng).
4. Prepare la reacción de la muestra en un tubo pcR de paredes delgadas añadiendo los reactivos enumerados en la Tabla 2.
5. Transfiera la mezcla de reacción a un ciclor térmico y ejecute la PCR con los megaprimers mutantes preparados en el paso 2.3 utilizando los siguientes parámetros: 1 min a 95 oC y 25 ciclos de 50 s a 95 oC, 50 s a 60 oC y 12 min a 68 oC. Conservar la reacción a 4oC.
6. Añadir 1 l de enzima de restricción dpnI directamente a la reacción de amplificación y mezclar suavemente.
7. Esgire la mezcla de reacción e incubar durante 2 h a 37oC.
8. Transformar T7 Express lisY/Iq células competentes de E. coli con 2 l de la reacción DpnI.
9. Inocular 100 ml de LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con las células transformadas e incubadurante durante la noche a 37 oC con agitación a 200 rpm.
10. Hacer existencias de congelador con 10 ml del cultivo nocturno en LB con 15% de glicerol y almacenar a -80 oC.

3. Selección de bacterias que expresan péptido biotinilado

NOTA: Esta parte del protocolo cubre el paso 2-5 de la Figura 1c. Se recomienda encarecidamente que el enfoque de selección se configure utilizando pBAD-BirA-eCPX-AP y pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) como controles positivos y negativos.

1. Inocular 100 ml de LB que contiene 1% de glucosa y 100 g/ml de ampicilina con 1 ml de la biblioteca BirA e incubar durante la noche a 37 oC con temblores a 200 rpm.
2. Inocular 5 ml de LB que contienen 1% de glucosa y 100 g/ml de ampicilina con 100 ml del cultivo nocturno.
3. Incubar durante 2 h y 30 min hasta que el cultivo alcance una OD₆₀₀ de aproximadamente 0,5.
4. Inducir la expresión de eCPX y BirA con 0,2% p/v L-arabinose, 100 m de isopropilo-D-1-tiogalactopiranoside (IPTG) y biotina de 100 oM y agitar el cultivo a 200 rpm durante 1 h a 37 oC.
5. Centrifugar la cultura durante 10 min a 5.000 x g y eliminar el sobrenadante.
6. Resuspenda las células en 1 ml del PBS helado y centrífuga a 5.000 x g durante 5 min.
7. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 400 ml de PBS helado y almacene las células en el hielo.
8. Retire 10 l de células resuspendidas y guárdelas en el hielo en un tubo de 1,5 ml etiquetado como "Entrada".
9. Lavar 20 ml de perlas magnéticas de estreptavidina en 1 ml de PBS helado y colocar el tubo en un separador de partículas magnéticas de sobremesa antes de retirar cuidadosamente el sobrenadante.
10. Resuspenda las perlas magnéticas de estreptavidina en 20 ml de PBS helado y transfiera a los 390 oL de células resuspendidas desde el paso 3.8.
11. Mezcle pipeteando suavemente y luego incubar durante 30 min a 4 oC.
    NOTA: No vórtice ya que esto puede atislar las células. La agregación de perlas se observa a menudo con una gran abundancia de bacterias que muestran un péptido biotinulado.
12. Coloque una columna con esferas ferromagnéticas en un separador de partículas magnéticas y lávela con 5 ml de PBS helado.
13. Transfiera las células y los perlas magnéticas de estreptavidina a la columna conectada en el separador.
14. Una vez que el depósito de la columna esté vacío, añadir 500 l de PBS helado y repetir hasta que la columna se haya lavado con un volumen total de 5 ml de PBS helado.
15. Retire la columna del separador y colóquela en un tubo de 1,5 ml.
16. Pipetear 1 ml del PBS helado en la columna y eluir las células etiquetadas magnéticamente aplicando el émbolo suministrado con la columna.
17. Transfiera el tubo de 1,5 ml a un separador de sobremesa y lave la celda etiquetada magnéticamente con 1 ml de PBS helado.
18. Resuspenda suavemente las células etiquetadas magnéticamente en 1 ml del PBS helado antes de retirar y almacenar 10 ml de la resuspensión en un tubo de 1,5 ml etiquetado como "Salida".
19. Inocular 100 ml de LB que contiene 1% de glucosa y 100 g/ml de ampicilina con las células etiquetadas magnéticamente e incubadurante durante la noche a 37 oC con temblores a 200 rpm.
20. Al día siguiente, utilice 10 ml del cultivo nocturno para hacer existencias de congelador con células en LB con 15% de glicerol y almacenar a -80 oC y 1 ml del cultivo nocturno para la siguiente ronda de selección, es decir, paso 3.2.
    NOTA: Generalmente, 3-5 rondas de selección se recomiendan para el enriquecimiento de bacterias de unión a la estreptavidina.

4. Cuantificación del enriquecimiento

NOTA: La cuantificación de las bacterias vivas en las muestras de "entrada" y "salida" se realiza después de cada ronda de selección mediante el revestimiento de diluciones en serie de las muestras y el posterior recuento de unidades formadoras de colonias (Unidades formadoras de colonias).

1. Agregue muestras de PBS heladas de 990 l a las muestras de entrada (del paso 3.8) y de salida (del paso 3.18) y etiquete los tubos "Entrada 10^-2"y "Salida 10^-2",respectivamente.
2. Realice 10 diluciones seriales de las muestras "Entrada 10^-2"y "Salida 10^-2"en PBS helado hasta que se alcance una dilución final de 10^-10 en la muestra de entrada y 10^-4 en la muestra de salida.
3. Placa 100 l de muestras de "Entrada 10^-6","Entrada 10^-8","Entrada 10^-10","Salida 10^-2","Salida 10^-3"y "Salida 10^-4"en placas LB/Amp e incubar durante la noche a 37oC.
4. Cuente el número de colonias en las placas con colonias claramente separadas. Multiplique el recuento de colonias con el factor de dilución para obtener el recuento de concentración bacteriana/100 l.
5. Calcule el recuento bacteriano total en las muestras de entrada y salida multiplicando la concentración de celda con el volumen de entrada (400 sL) y el volumen de salida (1 ml), respectivamente, y calcule el enriquecimiento dividiendo la salida con el recuento de celdas de entrada.
   NOTA: Un enriquecimiento significativo debe ser visible después de 3-5 rondas de selección

5. Caracterización de la variante BirA seleccionada

NOTA: La caracterización se puede realizar después de seleccionar variantes BirA de la primera biblioteca BirA; sin embargo, las variantes de BirA generalmente tienen baja actividad hacia el péptido. Por lo tanto, también se puede realizar una ronda adicional de mutación y selección antes de la caracterización. Por lo general, 10 clones de la ronda de selección final se aíslan para su posterior caracterización.

1. Inocular 5 ml LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con clones seleccionados de la ronda de selección final. Además, inocular 5 ml de LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con T7 Express lysY/Iq E. coli transformada con pBAD-BirA-eCPX-AP, que se utilizará como un control positivo para la mancha occidental descrita a continuación.
2. Incubar durante la noche a 37oC con agitación a 200 rpm.
3. Hacer poblaciones de congelación de 850 l de cada cultivo nocturno añadiendo glicerol a una concentración final del 15% al cultivo. Conservar a -80oC.
4. Inocular 5 ml de LB que contiene 100 g/ml de ampicilina con 100 ml de cultivo durante la noche e incubar a 37 oC con agitación a 200 rpm durante 2 h.
5. Extraiga el ADN plásmido del cultivo restante de 4 ml mediante el kit de extracción de ADN de minipreparación comercial. Realizar la secuencia de ADN en direcciones directas e inversas de las variantes BirA con imprimaciones pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) y pTrcHis rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG).
6. Añadir 0,2% p/v L-arabinose y 100 oM de IPTG y biotina de 100 m a los cultivos del paso 5.4 y agitar el cultivo a 200 rpm durante 1 h a 37 oC para inducir la expresión de las variantes eCPX y BirA.
7. Transfiera 65 ml del cultivo a tubos de 1,5 ml que contengan 25 ml del tampón de carga de la muestra y 10 ml del agente reductor.
8. Incubar a 95oC durante 5 min.
9. Cargue la muestra (incluido el control positivo) en un gel de poliacrilamida SDS al 12% junto con un marcador de tamaño y realice electroforesis de gel a 200 V durante aproximadamente 45 minutos hasta que las bandas estándar de 20, 25 y 37 kDa estén claramente separadas.
10. Suelte el gel del cassette y monte el sándwich para la hinchazón del gel en una membrana PVDF.
11. Electroblot a 35 V durante 2 h sobre hielo.
12. Retire la membrana PVDF e incubar en tampón de bloqueo [PBS, 0.05% Tween-20, 3% Skim Milk Powder] durante 1 h a temperatura ambiente con temblor.
13. Prepare la solución de detección de biotina diluyendo streptavidina-HRP 1:1,000 en PBST.
    NOTA: El tampón de bloqueo contiene biotina y, por lo tanto, no debe utilizarse como tampón de dilución para la estreptavidina-HRP.
14. Deseche el tampón de bloqueo, lave la membrana rápidamente en PBST [PBS, 0.05% Tween-20] y agregue la solución de detección de biotina. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente con agitación.
15. Deseche la solución de detección de biotina y lave bien la membrana en PBST durante 5 minutos dos veces y 10 minutos una vez con un suave temblor a temperatura ambiente.
16. Deseche el PBST, agregue la mezcla ECL de 2 ml e incuba durante 1 min con la agitación.
17. Seque la membrana rápidamente en un papel tisú y desarrolle la imagen en una película de rayos X o en un sistema digital de imágenes de gel.
    NOTA: En el carril cargado con el control positivo, dos bandas de reacción de estreptavidina distintas deben ser claramente visibles: una proteína de 30 kDa biotinilada con expresada endógenamente y la banda eCXP-AP de 22 kDa. Si las 10 colonias seleccionadas pueden biotinylar el péptido mostrado, una banda de 22 kDa debe ser visible. La intensidad de estas bandas es generalmente menor que el control positivo y, por lo tanto, puede requerir tiempos de exposición más largos.

Resultados

La mancha occidental de bacterias que expresan pBAD-BirA-eCPX-AP produce una banda de reacción de estreptavidina de 22 kDa consistente con el peso molecular de eCPX(Figura 2a). A diferencia de BirA-6xHis, eCPX-AP biotintida estaba presente en cultivos no inducidos e inducidos(Figura 2a) debido a un pequeño grado de actividad promotora de T7 incluso en cultivos no inducidos y posterior biotinylación de la AP por BirA endógeno. En...

Discusión

En cuanto a todos los métodos de selección, la rigela de los pasos de lavado es de suma importancia. Dado que las bacterias no necesitan ser eluted de las perlas antes de la amplificación de los clones seleccionados, la alta afinidad de unión entre la biotina y la estreptavidina se puede utilizar en lugar de utilizar ávidanos de menor afinidad, como se hizo anteriormente con el sistema de visualización de fago, para la selección de las variantes BirA^7,8. Esto gar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10% gel de poliacrilamida prefabricado	Bio-Rad	4561033
Ampicilin	Sigma-Aldrich	A1593
ApE - Un editor de plásmidos v2.0	NA	NA	descargado de http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Biotina	Sigma-Aldrich	B4501
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
DPBS (10x), sin calcio, sin magnesio	ThermoFischer Scientific	14200083
Enzima de restricción de DpnI	Nueva Inglaterra BioLabs	R0176
Dynabeads MyOne Estreptavidina C1	ThermoFischer Scientific	65001
GenElute Plasmid Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	PLN350
Kit GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis	Agilent Technologies	200552
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Immobilon-P Membrana PVDF	Millipore	IPVH15150
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LS Columnas	Miltenyi Biotec	130-042-401
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NEB 5-alfa competente E. coli	New England BioLabs	C2987
NuPAGE LDS Tampón de muestra (4x)	ThermoFischer Scientific	NP0007
NuPAGE Agente reductor de muestras (10x)	ThermoFischer Scientific	NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP	Addgene	121907	Se utilizó una plantilla y control positivo
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)	Addgene	121908	control negativo
Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad	New England BioLabs	M0491	Para la inserción de la secuencia peptídica en pBAD-BirA-eCPX-AP, cualquier polimerasa de alta fidelidad servirá
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Leche desnatada Polvo	Sigma-Aldrich	70166
Estreptavidina-HRP	Agilent Technologies	P0397
T7 Express lysY/Iq Competente E. coli	New England BioLabs	C3013
Triptona	Millipore	T9410
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL103001EA
Extracto de levadura	Sigma-Aldrich	Y1625