Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

Resumen

Los efectos de los inhibidores migratorios en la migración de células cancerosas de glioma en ensayos de invasión tridimensionales (3D) utilizando un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) se caracterizan por una microscopía confocal de alta resolución.

Resumen

El descubrimiento y desarrollo de fármacos en la investigación del cáncer se basa cada vez más en pantallas de drogas en un formato 3D. Se están descubriendo nuevos inhibidores dirigidos al potencial migratorio e invasivo de las células cancerosas, y en consecuencia a la propagación metastásica de la enfermedad, y se consideran tratamientos complementarios en cánceres altamente invasivos como los gliomas. Por lo tanto, se requiere generar datos que permitan el análisis detallado de las células en un entorno 3D después de la adición de un medicamento. La metodología descrita aquí, combinando ensayos de invasión esferoide con captura de imágenes de alta resolución y análisis de datos mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), permitió la caracterización detallada de los efectos del potencial inhibidor antimigratorio MI-192 en células de glioma. Los esferoides se generaron a partir de líneas celulares para ensayos de invasión en placas de 96 pocillos de bajo adherente y luego se prepararon para el análisis de CLSM. El flujo de trabajo descrito se prefirió sobre otras técnicas de generación de esferoides de uso común debido a la facilidad y la reproducibilidad. Esto, combinado con la resolución de imagen mejorada alcanzada por microscopía confocal en comparación con los enfoques convencionales de campo ancho, permitió la identificación y el análisis de cambios morfológicos distintos en las células migratorias en un entorno 3D tratamiento con el fármaco migratorio MI-192.

Introducción

Las tecnologías de esferoides tridimensionales para el descubrimiento de fármacos preclínicos y el desarrollo de fármacos potenciales contra el cáncer se están favoreciendo cada vez más con las pantallas de fármacos convencionales; por lo tanto, hay más desarrollo de medicamentos migratorios —prevención de migración e invasión—. Los fundamentos de estos desarrollos en el tratamiento del cáncer son claros: los ensayos de esferoides 3D representan un enfoque más realista para la detección de posibles fármacos contra el cáncer, ya que imitan la arquitectura de tumores 3D más fielmente que las culturas monocapa celular, recapitular las interacciones droga-tumor (cinética)....

Protocolo

1. Generación de esferoides celulares

Día 1

1. Prepare el medio de cultivo estándar según lo requiera la línea celular bajo investigación.
2. Llevar a cabo todos los pasos asociados al cultivo de tejido en una campana de cultivo de tejido utilizando técnicas de manejo estéril.
3. Triptiza y cuenta las células cancerosas. Utilice 20 ml de suspensión celular por placa. Mantenga las suspensiones celulares en tubos universales estériles claramente etiquetados.
4. Agregue un número predeterminado de celdas a cada pocal. Tanto el número inicial de células como el tamaño final de los esferoides requerid....

Resultados

La tecnología de esferoides tridimensionales está avanzando en la comprensión de las interacciones entre fármacos y tumores porque es más representativa del entorno específico del cáncer. La generación de esferoides se puede lograr de varias maneras; en este protocolo se utilizaron placas de baja adherencia de 96 pocillos. Después de probar varios productos de diferentes fabricantes, las placas utilizadas aquí fueron elegidas porque constantemente tuvieron el mejor desempeño en términos d.......

Discusión

Se describe una forma novedosa de crear esferoides de células cancerosas para la identificación de la actividad de los medicamentos migratorios mediante microscopía confocal de alta resolución. El uso de placas de bajo adherente sobre otras técnicas, como las gotas colgantes^15,ha facilitado un medio de generación de esferoides reproducibles y uniformes para su uso en los ensayos de migración e invasión de colágeno. Los puntos críticos de este protocolo son la eliminación del medio de crecimiento d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Colágeno I, cola de rata, 100 mg	354236 Corning		para el ensayo de invasión del glioma; esto es ofrecido por muchos distribuidores/fabricantes y deberá determinarse tanto para el tipo de ensayo previsto como para las líneas celulares utilizadas. Para las líneas celulares de cáncer de glioma, la cola de rata de colágeno tipo 1 (por ejemplo, Corning) es la opción preferida. El colágeno debe almacenarse a 4 & grados; C, en la oscuridad, hasta que sea necesario. No es aconsejable mezclar colágeno de diferentes lotes, ya que esto puede afectar la consistencia del colágeno polimerizado.
Cubreobjetos	varios	varios para	imágenes de microscopía
DMEM polvo	Sigma	D5648	necesarios a una concentración 5x para la solución de colágeno para el ensayo de invasión de glioma;   Puede adquirirse en forma de polvo, en agua bidestilada y, dependiendo de la composición final del medio de crecimiento, completarse con los aditivos necesarios. La solución completa 5x debe filtrarse a través de un sistema de filtro de jeringa (0.22 μ m) antes de su uso.
Suero fetal de ternero	Sigma	F7524-500ML	necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma
Portaobjetos	de	varios varios para	imágenes de microscopía
DMEM de alta glucosa	Gibco	41965062	necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma
Inhibidor	Tocris	varios	varios, de acuerdo con el diseño experimental; Los inhibidores se pueden comprar de fabricantes como Selleckchem y Tocris. Estos fabricantes ofrecen una descripción detallada de las características de los inhibidores, enlaces a referencias asociadas y sugerencias de concentraciones de trabajo. Al igual que con todos los inhibidores, pueden ser potencialmente tóxicos y deben manipularse de acuerdo con las pautas de salud y seguridad. Los inhibidores se preparan como soluciones madre según lo recomendado por el fabricante. Como ejemplo, utilizamos el inhibidor migrastático MI-192 para demostrar el uso de dichos inhibidores. Hemos probado una variedad de inhibidores migratorios de esta manera con resultados comparables.
Montaje	varios	varios	para imágenes microscópicas
NaOH (1 M)	varios	varios	NaOH se pueden comprar en la molaridad requerida o prepararse a partir de forma sólida. La solución preparada debe esterilizarse con un filtro utilizando un sistema de filtro de jeringa. Un M NaOH es corrosivo y se debe tener cuidado durante la preparación de la solución.
Paraformaldehído	varios	varios	varios para la fijación de esferoides y células; hacer al 4%, precaución peligro para la salud, asegurarse de que se cumplan las normas de salud y seguridad para la solución de colágeno para el ensayo de invasión
Pastettes (pipeta graduada, 3 mL)	varios	varios	varios para el ensayo de invasión, eliminación de solución
PBS, estéril para cultivo de tejidos	Sigma	D1408-500ML	necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma y lavados para tinción
Pluma/estreptococo (antibióticos)	Sigma	P4333	necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma
Anticuerpo primario, anticuerpo secundario, DAPI, faloidina	varios	varios hay	muchos fabricantes de estos reactivos, para anticuerpos marcados secundarios recomendamos Alexa Fluor (sondas moleculares). Aquí utilizamos para los anticuerpos primarios el anticuerpo de tubulina antiacetilada de ratón (1/100, Abcam). Para los anticuerpos secundarios se utilizó el anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488 anti-ratón 1/500, Molecular Probes. Para la tinción nuclear se utilizó DAPI (muchos fabricantes) y la tinción de actina Phalloidin (muchos fabricantes), ambas utilizadas con la dilución recomendada de 1/500.
Bicarbonato de sodio	Sigma	S5761	necesario para la solución de colágeno para el ensayo de invasión del glioma a una concentración 5x
Piruvato de sodio	Sigma	P5280	necesario para la solución de colágeno para el ensayo de invasión del glioma a una concentración 5x
Tripsina	Sigma	T4049	para la tripsinización
Placas de fijación ultra bajas Sigma	/Nunc	CLS7007-24EA	para el ensayo de invasión de glioma; Se requiere una placa de baja adherencia, y se prefieren placas de 96 pocillos para permitir el cribado a gran escala de los compuestos bajo investigación. Hay varias placas de baja adherencia disponibles comercialmente; Es aconsejable probar una variedad de placas para una generación óptima de esferoides. En nuestra experiencia, Costar Ultra Low Cluster con tapa, fondo redondo, funciona mejor para la generación de esferoides a partir de células de cáncer de glioma en términos de 100% de formación de esferoides y reproducibilidad. Estas placas también se utilizaron con éxito para la generación de esferoides de glioma a partir de material derivado del paciente, células de cáncer de vejiga y ovario en nuestro laboratorio. Además, en estas placas se pueden utilizar neuroesferas madre o progenitoras para facilitar la generación de neurosferas-esferoides estandarizadas
Stripettes (pipetas serológicas, estériles, 5 mL y 10 mL)	varias, por ejemplo, Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	para el cultivo de tejidos y la preparación de colágeno
Varios multicanal (50 - 250 μ L) y pipetas monocanal (10 μ L, 50 y mu; L, 200 μ L 1 mL)	varios	varios	para el manejo de células y esferoides
Microscopía de campo amplio	varios	varios	para la observación de la generación de esferoides y la obtención de imágenes de esferoides; aquí se capturaron imágenes de fluorescencia de campo amplio utilizando un sistema de imágenes celulares EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipado con un objetivo de aceite Plan Apochromat 63x 1.4 NA	Zeiss	cita del fabricante	Las imágenes confocales se capturaron utilizando un Zeiss LSM 880 CLSM equipado con un objetivo de aceite Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Se utilizaron láseres de diodo de 405 nm, 458/488/514 nm de argón multilínea y HeNe de 594 nm para excitar Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 y DAPI respectivamente. Para cada imagen se capturó una única sección óptica representativa, con todos los ajustes, tanto antes como después de la captura de la imagen, con fines comparativos. Todas las imágenes se procesaron posteriormente utilizando el software de imagen Zen asociado y Adobe Photoshop.

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