Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

Resumen

Los efectos de los inhibidores migratorios en la migración de células cancerosas de glioma en ensayos de invasión tridimensionales (3D) utilizando un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) se caracterizan por una microscopía confocal de alta resolución.

Resumen

El descubrimiento y desarrollo de fármacos en la investigación del cáncer se basa cada vez más en pantallas de drogas en un formato 3D. Se están descubriendo nuevos inhibidores dirigidos al potencial migratorio e invasivo de las células cancerosas, y en consecuencia a la propagación metastásica de la enfermedad, y se consideran tratamientos complementarios en cánceres altamente invasivos como los gliomas. Por lo tanto, se requiere generar datos que permitan el análisis detallado de las células en un entorno 3D después de la adición de un medicamento. La metodología descrita aquí, combinando ensayos de invasión esferoide con captura de imágenes de alta resolución y análisis de datos mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), permitió la caracterización detallada de los efectos del potencial inhibidor antimigratorio MI-192 en células de glioma. Los esferoides se generaron a partir de líneas celulares para ensayos de invasión en placas de 96 pocillos de bajo adherente y luego se prepararon para el análisis de CLSM. El flujo de trabajo descrito se prefirió sobre otras técnicas de generación de esferoides de uso común debido a la facilidad y la reproducibilidad. Esto, combinado con la resolución de imagen mejorada alcanzada por microscopía confocal en comparación con los enfoques convencionales de campo ancho, permitió la identificación y el análisis de cambios morfológicos distintos en las células migratorias en un entorno 3D tratamiento con el fármaco migratorio MI-192.

Introducción

Las tecnologías de esferoides tridimensionales para el descubrimiento de fármacos preclínicos y el desarrollo de fármacos potenciales contra el cáncer se están favoreciendo cada vez más con las pantallas de fármacos convencionales; por lo tanto, hay más desarrollo de medicamentos migratorios —prevención de migración e invasión—. Los fundamentos de estos desarrollos en el tratamiento del cáncer son claros: los ensayos de esferoides 3D representan un enfoque más realista para la detección de posibles fármacos contra el cáncer, ya que imitan la arquitectura de tumores 3D más fielmente que las culturas monocapa celular, recapitular las interacciones droga-tumor (cinética) con mayor precisión, y permitir la caracterización de la actividad farmacológica en un entorno relacionado con el tumor. Además, el aumento de la resistencia a los medicamentos quimiotóxicos en muchos tipos de cáncer y las altas tasas de mortalidad entre los pacientes con cáncer debido a la metástasis potenciada por la capacidad de las células cancerosas para migrar a sitios tumorales distantes apoya la inclusión de agentes quimioterápicos el potencial migratorio de las células cancerosas como tratamiento adyuvante en futuros ensayos clínicos de cáncer¹. Este es particularmente el caso en cánceres altamente invasivos, como los glioblastomas de alto grado (GBM). El manejo de GBM incluye cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, incluso con el tratamiento combinado, la mayoría de los pacientes recaen dentro de 1 año del diagnóstico inicial con una mediana de supervivencia de 11-15 meses^2,3. En los últimos años se han realizado enormes avances en el campo de la tecnología 3D: sistemas rotativos, estructuras microfabricadas y andamios 3D, y otros ensayos individuales se están mejorando continuamente para permitir realizar pruebas rutinarias a gran escala^{4, 5,6,7}. Sin embargo, los resultados obtenidos de estos ensayos deben analizarse de manera significativa porque la interpretación de datos a menudo se ve obstaculizada por los intentos de analizar datos generados por 3D con sistemas de análisis de imágenes 2D.

A pesar de ser preferible en términos de velocidad de adquisición de imagen y reducción de la fototoxicidad, la mayoría de los sistemas de campo ancho siguen estando limitados por la resolución^8. Por lo tanto, aparte de las lecturas de datos relacionadas con la eficacia de los medicamentos, los efectos detallados de la acción del fármaco en las estructuras celulares 3D de las células migratorias se pierden inevitablemente si se imágen utilizando un sistema de campo amplio. Por el contrario, la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) captura imágenes de alta calidad seccionadas ópticamente que se pueden reconstruir y renderizar en 3D después de la adquisición utilizando software informático. Por lo tanto, CLSM es fácilmente aplicable a las estructuras celulares 3D complejas de imágenes, lo que permite el interrogatorio de los efectos de los inhibidores antimigrastres en las estructuras 3D y análisis en profundidad de los mecanismos de migración celular. Esto sin duda guiará el desarrollo futuro de fármacos migratorios. Aquí, se describe un flujo de trabajo combinado de generación de esferoides, tratamiento de fármacos, protocolo de tinción y caracterización mediante microscopía confocal de alta resolución.

Protocolo

1. Generación de esferoides celulares

Día 1

1. Prepare el medio de cultivo estándar según lo requiera la línea celular bajo investigación.
2. Llevar a cabo todos los pasos asociados al cultivo de tejido en una campana de cultivo de tejido utilizando técnicas de manejo estéril.
3. Triptiza y cuenta las células cancerosas. Utilice 20 ml de suspensión celular por placa. Mantenga las suspensiones celulares en tubos universales estériles claramente etiquetados.
4. Agregue un número predeterminado de celdas a cada pocal. Tanto el número inicial de células como el tamaño final de los esferoides requeridos depende de la tasa de proliferación de la línea celular que se está investigando.
   NOTA: Para las líneas celulares de glioma establecidas como U251 y KNS42^9,10, 5 x 10³ células/ml producirán un esferoide microscópicamente visible (200 u 800 m) después de 4 días de incubación.
5. Resuspenda las células en tubos universales mediante una inversión suave para evitar el aglutinamiento celular. Pipetear 200 l de la suspensión celular en cada pocal de una placa de 96 pocillos. Si no se requieren todos los pozos, es aconsejable añadir 200 éL de 1x PBS a cada pozo vacío para evitar la evaporación.
6. Incubar las células en una incubadora de forma normal a 37 oC.
   NOTA: Las líneas celulares como las líneas celulares del cáncer de glioma formarán esferoides dentro de 24 h. Permitir que se forme la arquitectura celular 3D incubando el esferoide durante 72 h.

Día 2

7. Compruebe las células mediante microscopía de campo brillante después de 24 h. Dependiendo de la línea celular, las células pueden haber formado un esferoide detectable en la parte inferior del pozo.
   NOTA: Las líneas celulares de cáncer de glioma establecidas forman fácilmente esferoides dentro de las 24 h. Las líneas celulares de cáncer de glioma derivadas del paciente pueden tardar hasta 1-2 semanas.

2. Ensayo de invasión de colágeno

Día 3

1. Colocar colágeno, medio de cultivo 5x, 1 M NaOH y un tubo de 20 ml sobre hielo.
2. Añadir con cuidado y lentamente 10,4 ml de colágeno frío en un tubo de cultivo refrigerado. Evite las burbujas. Esta cantidad de colágeno es suficiente para una placa de 96 pocillos. La ampliación es posible, pero se recomienda preparar un tubo de 20 ml por placa a la vez.
3. Añadir suavemente 1,52 ml de medio de cultivo 5x estéril frío. Evite las burbujas.
4. Justo antes de su uso, agregue suavemente 72 ml de frío estéril 1 M NaOH. Mantenga la solución en hielo.
5. Mezcle suavemente pipeteando. Evite las burbujas. La mezcla eficiente conduce a un cambio de color (de rojo a rojo anaranjado (pH 7.4) en el medio. Deje la mezcla sobre hielo hasta su uso.
6. Paso crucial: Retire 190 ml de sobrenadante de la placa de 96 pocillos preparada en el día 1. Tenga mucho cuidado de no molestar a los esferoides que se formaron en la parte inferior del pozo. Utilice la pipeta en un ángulo hacia el lado, no el centro, del pozo.
7. Agregue suavemente 100 s de la mezcla de colágeno a cada poca. Para evitar cualquier perturbación esferoide, pipetee la mezcla por el lado del pozo. Evite las burbujas. Mantenga cualquier mezcla de colágeno restante en el tubo de 20 ml a temperatura ambiente para evaluar la polimerización.
8. Incubar la placa en la incubadora durante al menos 10 minutos para permitir que el colágeno se polimerice. Como pauta, si el colágeno sobrante se ha puesto, convirtiéndose en semisólido y similar a una esponja, los esferoides están listos para ser tratados con inhibidor.
9. Añadir los fármacos o inhibidores a la concentración 2x al medio de cultivo. Añadir el medio suavemente a cada pocal (100 ml por pozo). Una vez más, pipetear el medio por el lado del pozo para evitar la perturbación de los esferoides.
10. Observe e ilumine cada esferoide mediante microscopía de campo brillante a veces T a 0 h, 24 h, 48 h y 72 h para evaluar la actividad del fármaco. A continuación, devuelva la placa a la incubadora.
    NOTA: Dependiendo del comportamiento invasivo de la línea celular, la migración lejos del núcleo esferoide original se puede observar a partir de las 24 horas en adelante.

3. Preparación de esferoides integrados de colágeno y células migratorias para microscopía confocal

1. Coloque la placa en una capucha de cultivo de tejido y retire suavemente el sobrenadante (200 l). Una vez más, tenga cuidado de no molestar al esferoide y evitar tocar el colágeno, ya que esto puede interferir con el tapón de colágeno.
2. Sustituya el sobrenadante por 100 s de 1pbS. Repita este paso de lavado 3x.
3. Retire el lavado final y sustitúyalo con un 4% de formaldehído en 1PBS (100 ml por poca).
   PRECAUCION: El formaldehído es un carcinógeno potencial. Manipule con cuidado de acuerdo con las pautas de salud y seguridad.
4. Coloque la placa de 96 pocillos en un banco de laboratorio, cubra con papel de aluminio y déjela durante 24 horas a temperatura ambiente.
5. Retire cuidadosamente el formaldehído y sustitúylo por 1pbS. Repita este 1x lavado PBS 3x.
6. Preparar 0.1% Triton X-100 en 1x PBS. Retire el lavado de 1x PBS y sustitúyalo por 100 ml de la solución Triton X-100. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo con 1 x PBS y 0.05% leche desnatada en polvo y mezcle bien.
7. Retire Triton X-100 y lave 3x con 1pbS. Añadir 100 sL de solución de bloqueo a cada poca y incubar durante 15 min.
8. Diluir el anticuerpo primario requerido en el tampón de bloqueo a la concentración predeterminada. Aquí, utilice anticuerpo anti-ratón IgG acetilado de tubulina (1:100).
9. Centrifugar la mezcla tampón de bloqueo de anticuerpos primaria durante 5 min a 15.682 x g. Retire con cuidado la solución de bloqueo y agregue el sobrenadante (25 x 50 l) a cada poca. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h.
10. Retire la solución de anticuerpos y lave 3 veces con 1 pbS (100 ml por poca).
11. Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración recomendada o predeterminada, además de las manchas fluorescentes adicionales. Aquí, utilice 1:500 anti-ratón fluoróforo-488 anticuerpo conjugado, faloidin-594 (1:500) para la tinción de la actina, y la mancha de ADN (DAPI).
12. Una vez más, centrifugar la solución de anticuerpos secundarios durante 5 min a 13.000 rpm.
13. Retire la solución de bloqueo de cada pocal y añada 25 x 50 l de la mezcla secundaria de anticuerpos/phalloidin/DAPI. Incubar en la oscuridad durante 1,5 h a temperatura ambiente.
14. Retire la solución secundaria de anticuerpos y lave 3 veces con 1 pbS (100 ml por poca).
15. Levante con cuidado tapones de colágeno individuales mediante succión con una pipeta de plástico (200 l) en el centro de un portaobjetos de vidrio liso de alta calidad.
16. Agregue una gota de un mountante adecuado al tapón de colágeno, asegurándose de que el enchufe esté completamente cubierto. Evite las burbujas.
17. Aplicar el cubreobjetos del espesor óptimo para el objetivo del microscopio que se utilizará para la toma de imágenes y permitir que se ajuste durante la noche. Guarde los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad.

4. Microscopía de fluorescencia

1. Capture imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal adecuado.

Resultados

La tecnología de esferoides tridimensionales está avanzando en la comprensión de las interacciones entre fármacos y tumores porque es más representativa del entorno específico del cáncer. La generación de esferoides se puede lograr de varias maneras; en este protocolo se utilizaron placas de baja adherencia de 96 pocillos. Después de probar varios productos de diferentes fabricantes, las placas utilizadas aquí fueron elegidas porque constantemente tuvieron el mejor desempeño en términos d...

Discusión

Se describe una forma novedosa de crear esferoides de células cancerosas para la identificación de la actividad de los medicamentos migratorios mediante microscopía confocal de alta resolución. El uso de placas de bajo adherente sobre otras técnicas, como las gotas colgantes^15,ha facilitado un medio de generación de esferoides reproducibles y uniformes para su uso en los ensayos de migración e invasión de colágeno. Los puntos críticos de este protocolo son la eliminación del medio de crecimiento d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Colágeno I, cola de rata, 100 mg	354236 Corning		para el ensayo de invasión del glioma; esto es ofrecido por muchos distribuidores/fabricantes y deberá determinarse tanto para el tipo de ensayo previsto como para las líneas celulares utilizadas. Para las líneas celulares de cáncer de glioma, la cola de rata de colágeno tipo 1 (por ejemplo, Corning) es la opción preferida. El colágeno debe almacenarse a 4 & grados; C, en la oscuridad, hasta que sea necesario. No es aconsejable mezclar colágeno de diferentes lotes, ya que esto puede afectar la consistencia del colágeno polimerizado.
Cubreobjetos	varios	varios para	imágenes de microscopía
DMEM polvo	Sigma	D5648	necesarios a una concentración 5x para la solución de colágeno para el ensayo de invasión de glioma;   Puede adquirirse en forma de polvo, en agua bidestilada y, dependiendo de la composición final del medio de crecimiento, completarse con los aditivos necesarios. La solución completa 5x debe filtrarse a través de un sistema de filtro de jeringa (0.22 μ m) antes de su uso.
Suero fetal de ternero	Sigma	F7524-500ML	necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma
Portaobjetos	de	varios varios para	imágenes de microscopía
DMEM de alta glucosa	Gibco	41965062	necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma
Inhibidor	Tocris	varios	varios, de acuerdo con el diseño experimental; Los inhibidores se pueden comprar de fabricantes como Selleckchem y Tocris. Estos fabricantes ofrecen una descripción detallada de las características de los inhibidores, enlaces a referencias asociadas y sugerencias de concentraciones de trabajo. Al igual que con todos los inhibidores, pueden ser potencialmente tóxicos y deben manipularse de acuerdo con las pautas de salud y seguridad. Los inhibidores se preparan como soluciones madre según lo recomendado por el fabricante. Como ejemplo, utilizamos el inhibidor migrastático MI-192 para demostrar el uso de dichos inhibidores. Hemos probado una variedad de inhibidores migratorios de esta manera con resultados comparables.
Montaje	varios	varios	para imágenes microscópicas
NaOH (1 M)	varios	varios	NaOH se pueden comprar en la molaridad requerida o prepararse a partir de forma sólida. La solución preparada debe esterilizarse con un filtro utilizando un sistema de filtro de jeringa. Un M NaOH es corrosivo y se debe tener cuidado durante la preparación de la solución.
Paraformaldehído	varios	varios	varios para la fijación de esferoides y células; hacer al 4%, precaución peligro para la salud, asegurarse de que se cumplan las normas de salud y seguridad para la solución de colágeno para el ensayo de invasión
Pastettes (pipeta graduada, 3 mL)	varios	varios	varios para el ensayo de invasión, eliminación de solución
PBS, estéril para cultivo de tejidos	Sigma	D1408-500ML	necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma y lavados para tinción
Pluma/estreptococo (antibióticos)	Sigma	P4333	necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma
Anticuerpo primario, anticuerpo secundario, DAPI, faloidina	varios	varios hay	muchos fabricantes de estos reactivos, para anticuerpos marcados secundarios recomendamos Alexa Fluor (sondas moleculares). Aquí utilizamos para los anticuerpos primarios el anticuerpo de tubulina antiacetilada de ratón (1/100, Abcam). Para los anticuerpos secundarios se utilizó el anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488 anti-ratón 1/500, Molecular Probes. Para la tinción nuclear se utilizó DAPI (muchos fabricantes) y la tinción de actina Phalloidin (muchos fabricantes), ambas utilizadas con la dilución recomendada de 1/500.
Bicarbonato de sodio	Sigma	S5761	necesario para la solución de colágeno para el ensayo de invasión del glioma a una concentración 5x
Piruvato de sodio	Sigma	P5280	necesario para la solución de colágeno para el ensayo de invasión del glioma a una concentración 5x
Tripsina	Sigma	T4049	para la tripsinización
Placas de fijación ultra bajas Sigma	/Nunc	CLS7007-24EA	para el ensayo de invasión de glioma; Se requiere una placa de baja adherencia, y se prefieren placas de 96 pocillos para permitir el cribado a gran escala de los compuestos bajo investigación. Hay varias placas de baja adherencia disponibles comercialmente; Es aconsejable probar una variedad de placas para una generación óptima de esferoides. En nuestra experiencia, Costar Ultra Low Cluster con tapa, fondo redondo, funciona mejor para la generación de esferoides a partir de células de cáncer de glioma en términos de 100% de formación de esferoides y reproducibilidad. Estas placas también se utilizaron con éxito para la generación de esferoides de glioma a partir de material derivado del paciente, células de cáncer de vejiga y ovario en nuestro laboratorio. Además, en estas placas se pueden utilizar neuroesferas madre o progenitoras para facilitar la generación de neurosferas-esferoides estandarizadas
Stripettes (pipetas serológicas, estériles, 5 mL y 10 mL)	varias, por ejemplo, Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	para el cultivo de tejidos y la preparación de colágeno
Varios multicanal (50 - 250 μ L) y pipetas monocanal (10 μ L, 50 y mu; L, 200 μ L 1 mL)	varios	varios	para el manejo de células y esferoides
Microscopía de campo amplio	varios	varios	para la observación de la generación de esferoides y la obtención de imágenes de esferoides; aquí se capturaron imágenes de fluorescencia de campo amplio utilizando un sistema de imágenes celulares EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipado con un objetivo de aceite Plan Apochromat 63x 1.4 NA	Zeiss	cita del fabricante	Las imágenes confocales se capturaron utilizando un Zeiss LSM 880 CLSM equipado con un objetivo de aceite Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Se utilizaron láseres de diodo de 405 nm, 458/488/514 nm de argón multilínea y HeNe de 594 nm para excitar Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 y DAPI respectivamente. Para cada imagen se capturó una única sección óptica representativa, con todos los ajustes, tanto antes como después de la captura de la imagen, con fines comparativos. Todas las imágenes se procesaron posteriormente utilizando el software de imagen Zen asociado y Adobe Photoshop.

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