En este estudio se tomó la imagen de la actividad fagocítica de macrófagos contra las células cancerosas, específicamente las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. El modelo de cocultivo de células vivas se estableció y observó utilizando una combinación de microscopía de contraste de interferencia fluorescente y diferencial. Esta evaluación se realizó utilizando un software de imágenes para desarrollar vídeo de lapso de tiempo multipunto.
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Artículo de método
Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos asociados a tumores (AMA) se han identificado como un componente importante para el crecimiento tumoral, la invasión, la metástasis y la resistencia a las terapias oncológicas. Sin embargo, los macrófagos asociados al tumor pueden ser perjudiciales para el tumor dependiendo del microambiente tumoral y pueden alterar de forma reversible sus características fenotípicas mediante la antagonización de la actividad citotóxica de las células inmunitarias o mejorando la respuesta antitumoral. Las acciones moleculares de los macrófagos y sus interacciones con las células tumorales (p. ej., fagocitosis) no se han estudiado ampliamente. Por lo tanto, la interacción entre las células inmunitarias (Tam de subtipo M1/M2) y las células cancerosas en el microambiente tumoral es ahora un foco de investigación de inmunoterapia contra el cáncer. En el presente estudio, se desarrolló un modelo de cocultivo de células vivas de macrófagos M1 inducidos y células de carcinoma 4T1 mamaria de ratón para evaluar la actividad fagocítica de los macrófagos utilizando una función de vídeo de lapso de tiempo utilizando la microscopía de contraste de fase, fluorescente y contraste de interferencia diferencial (DIC). El método actual puede observar y documentar imágenes multipunto de células vivas de fagocitosis. La fagocitosis de células 4T1 por macrófagos M1 se puede observar mediante microscopía fluorescente antes de manchar las células 4T1 con éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE). La publicación actual describe cómo coculturar macrófagos y células tumorales en una sola placa de diagnóstico por imágenes, polarizar los macrófagos M1 y registrar eventos multipunto de macrófagos que envuelven células 4T1 durante 13 h de cocultura.
Introducción
Los macrófagos son la primera línea de defensa inmune y desempeñan un papel en la orquestación de respuestas inmunitarias contra patógenos y materiales extraños, incluidas las células cancerosas. Son un fagocito especializado que destruye y elimina las partículas no deseadas en el cuerpo. Los macrófagos aportan funciones defensivas como el aclaramiento de células apoptoticas y microorganismos y el reclutamiento de otras células inmunitarias1. Los macrófagos pueden diferenciarse en dos tipos diferentes, los macrófagos M1 y M2, en respuesta a las señales ambientales2. Los macrófagos polarizados en M1 (es decir, los macrófagos activados clásicamente) se activan mediante el interferón citoquina (IFN-o) y los lipopolisacáridos (LPS) y participan en la respuesta inflamatoria, el aclaramiento de patógenos, la fagocitosis eficiente y la inmunidadtumoralicida 3,4. Los macrófagos M2 están estrechamente relacionados con los macrófagos asociados a tumores (AMA) y tienen propiedades antiinflamatorias y de promoción tumoral4.
Fagocitosis, derivada del griego antiguo (favioina), que significa "devorar", (kytos), que significa "célula", y -osis, que significa "proceso"5. La fagocitosis es un proceso mediado por receptores en el que los fagocitos (incluidos macrófagos, monocitos y neutrófilos) matan y envuelven patógenos invasores, limpian partículas extrañas y limpian desechos de células apoptóticas claras. Los macrófagos asociados a tumores (AMA) se encuentran en el estroma en diferentes tumores, incluyendo el cáncer de mama, y tienen funciones protumorales6,7,lo que resulta en resistencia a la fagocitosis. Todavía no se entiende el mecanismo detallado de la fagocitosis de células tumorales por macrófagos.
Este estudio presenta un método de dos pasos: 1) las células de carcinoma mamario de ratón 4T1 y los macrófagos polarizados M1 están cocultivos, y 2) la actividad fagocítica de los macrófagos se evalúa mediante microscopía de vídeo de células vivas. El tinte fluorescente CFSE se utilizó para manchar las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. La mancha etiqueta las células 4T1 para distinguirlas de los macrófagos M1 cocultivos dentro de una sola placa de imágenes. Los macrófagos RAW 264.7 se polarizan con LPS e IFN-o en un fenotipo M1. Para garantizar una polarización completa, se realizó inmunomancha con anticuerpos anti-iNOS conjugados a FITC. Posteriormente, se adquirió una serie multipunto de imágenes de lapso de tiempo para observar múltiples eventos, incluyendo fagocitosis, dentro de la cocultura.
Una mejor comprensión de las interacciones entre las células tumorales y los macrófagos puede conducir a una posible inmunoterapia contra el cáncer. La imagen de células en vivo ofrece una visión detallada de la dinámica celular en un entorno en tiempo real y se ha utilizado para estudiar la migración celular, el cribado fenotípico, la apoptosis y la citotoxicidad8,9 en neurociencia, biología del desarrollo y descubrimiento de fármacos. Aunque el tumor propuesto en este estudio es el cáncer de mama, el método también se puede aplicar a múltiples células diana y células efectoras distintas.
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Protocolo
NOTA: Las secciones 1-6 describen el modelo de cocultivo de las células de carcinoma mamario del ratón 4T1 y los macrófagos de ratón RAW 264.7. La sección 7 describe la evaluación del lapso de tiempo de las células 4T1 fagoyted de los macrófagos M1.
1. Culturing 4T1 células de carcinoma mamario de ratón y macrófagos de ratón RAW 264.7
- Descongelar un vial de 4T1 y RAW 264.7 conservado sofocar 4T1 y RAW 264.7 pasar 6 células por agitación suave en un baño de agua a 37 oC o la temperatura de crecimiento normal para las líneas celulares.
NOTA: La descongelación debe hacerse rápidamente, aproximadamente en un plazo de 2 minutos. Para evitar la contaminación, retire el vial del baño de agua y descontaminelo rociándolo con 70% de etanol. Para evitar la deriva genética, especialmente para los macrófagos, utilice un número de paso bajo (es decir, menos de 20). - Diluir las células descongeladas en 10 ml de medio DMEM completo en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar las células a 600 x g durante 5 min para obtener un pellet celular.
NOTA: El medio completo de DMEM complementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), 200 U/ml de penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina se utiliza en todo el protocolo. - Aspirar cuidadosamente el medio, resuspender las células en 8 ml de medio completo y transferira a un matraz tratado con cultivo de tejido de 25 cm2. Cultivo de células 4T1 y RAW 264.7 en medio DMEM completo a 37oC con 5%co2.
NOTA: Resuspenda los gránulos celulares suavemente y agregue la suspensión celular al matraz de cultivo gota a gota para evitar matar las células. - Después de 1 semana de cultivo para permitir la adherencia celular, monitoree el matraz diariamente y agregue 8 ml de medio DMEM completo según sea necesario.
2. Inmunomanchado de macrófagos m1 polarizados RAW 264.7
- A medida que la confluencia de células RAW 264.7 alcance el 70-80%, deseche los medios de cultivo y enjuague suavemente 2x con al menos 2 ml de PBS.
NOTA: Antes de sembrar las células RAW 264.7, asegúrese de que no se ha producido ninguna diferenciación celular (es decir, fenotipo similar a la dendrita y/o aumento del tamaño de la célula). Si los cambios de morfología celular son visibles, deseche el cultivo y descontese una nueva línea celular del vial de paso anterior. - Preparar los macrófagos para la recolección desalojando suavemente las células adherentes usando un rascador de células y transferirlos a un tubo cónico de 15 ml.
- Cuente las células usando un hemocitómetro y prepare una suspensión celular de 1 x 105 células/plato usando un medio DMEM completo.
- Semilla 2 mL de la suspensión de macrófagos en dos platos de imagen. Incubar las células de 2 a 3 h a 37 oC con un 5% deCO2 para permitir la adherencia celular.
- Prepare los medios de polarización M1 añadiendo 100 ng/mL LPS y 20 ng/mL IFN-o en el medio DMEM completo10,11.
- Deseche el sobrenadante de cultivo de los macrófagos y lave cuidadosamente las monocapas en el plato 2x con al menos 1 mL de PBS.
- Añadir 2 ml de medios de polarización M1 en uno de los platos de imágenes, permitir que las células RAW 264.7 induzcan el fenotipo de macrófagoM 1 e incubar 2-3 h a 37 oC con 5% de CO2.
NOTA: Semilla RAW 264.7 macrófagos en una placa de imágenes con DMEM complementado con 10% FBS como control para la tinción de anticuerpos anti-iNOS. Etiquetar los platos de imagen RAW (control) y M1 macrófagos (LPS y IFN-o polarizados), respectivamente. - Antes de la inmunomancha, fijar las células de los macrófagos RAW 264.7 y M1 usando 2 ml de paraformaldehído al 4% e incubar durante 15 min a 37 oC (temperatura ambiente, RT).
- Retire el sobrenadante y lave la monocapa celular con 1 ml de PBS al menos 3 veces.
- Quench con 2 mL de cloruro de amonio de 50 mM en PBS e incubar durante 15 min a RT.
- Permeabilizar usando 2 mL de 0.3% Triton X-100 en PBS durante 15 min en RT.
- Retire el sobrenadante y lave la monocapa celular con 1 ml de PBS al menos 3 veces.
- Bloquear usando 2 mL de 10% FBS en PBS durante 30 min en RT.
NOTA: El paso de bloqueo en la inmunomancha ción es minimizar la unión no específica de los anticuerpos dentro de la célula. - Retire el sobrenadante y lave la monocapa celular con 1 ml de PBS al menos 3 veces.
- Incubar con 2 mL de anti-iNOS-FITC en PBS y 1% FBS durante la noche a 4oC.
NOTA: Etiquete las células utilizando la dilución de anticuerpos adecuada de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Proteja los platos de la luz cubriéndolos con papel de aluminio a partir de este momento. - Retire el sobrenadante y lave la monocapa celular con 1 ml de PBS al menos 3 veces.
- Incubar 1 mL de 300 nM 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) en platos de imagen durante 10 min en 37 oC, en la oscuridad cubriendo con papel de aluminio.
- Lave las células con 1 ml de PBS al menos 3 x y agregue 1 ml de medio DMEM completo a los platos de imágenes.
NOTA: Las células ya están listas para la toma de imágenes por fluorescencia. La configuración del microscopio necesitará una etapa invertida y filtros de excitación para las manchas elegidas (en este caso, FITC y DAPI). - Encienda el microscopio y cargue el software de imágenes. Monte la placa de imágenes en el microscopio y ajuste el enfoque para observar los macrófagos RAW 264.7 y M1. Optimice la apariencia de las imágenes FITC y DAPI de contraste de fase ajustando la luz transmitida y los tiempos de exposición.
NOTA: Comience la toma de imágenes cuando todos los puntos estén enfocados y los canales estén optimizados. - Capturar imágenes FITC y DAPI de contraste de fase(Figura 1).
3. Sembrar células de carcinoma mamario de ratón 4T1
- A medida que la confluencia de células 4T1 alcance el 70-80%, deseche los medios de cultivo y enjuague suavemente 2veces con al menos 2 ml de PBS. Añadir 1 ml de tripsina precalentada para disociar las células e incubar hasta 20 min a 37 oC.
NOTA: Observe las células bajo un microscopio. Las celdas separadas se redondearán. - Una vez que las células se separan, transfieralas a un tubo cónico de 15 ml y agregue 2 ml de medio DMEM completo precalentado para inactivar la trippsina. Disperse suavemente el medio pipeteando la superficie de la capa celular para recuperar las células. Luego, centrífuga a 600 x g durante 5 min para obtener un pellet celular.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de medio DMEM completo precalentado.
- Cuente las células usando un hemocitómetro y semilla 1 x 105 4T1 células en 2 ml de medio DMEM completo en cada uno de dos platos de imágenes de fondo de vidrio de 35 mm tratados con cultivo de tejido. Incubar las células durante la noche a 37oC con un 5% deCO2.
NOTA: Células de cultivo 4T1 en uno de los platos de imagen con medios de polarización M1 y etiqueta 4T1-Inductor (control). Esto es para asegurar el crecimiento normal de las células 4T1 cuando se exponen a los inductores.
4. Etiquetado de células de carcinoma mamario de ratón 4T1 con tinción CFSE
- En primer lugar, retire los medios existentes de las placas de imágenes de células 4T1. Lave la monocapa celular al menos 2 veces con 1 ml de PBS.
- Preparar 5 m de solución de tinción de CFSE diluyendo CFSE en 1 ml de PBS. Añadir 1 mL de solución de tinción CFSE de 5 m en cada plato de imágenes e incubar las células durante 20 minutos a RT o 37 oC, en la oscuridad.
NOTA: Etiquete las células utilizando la concentración de trabajo CFSE adecuada de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y los experimentos preliminares para obtener la concentración óptima de tinción de CFSE. La eficiencia del etiquetado será mayor si CFSE se diluye en PBS. - Quench la tinción mediante la adición de un volumen igual de medio DMEM completo que contiene 10% FBS y solución de tinción a las células e incubar durante 5 minutos en RT en la oscuridad.
- Deseche la solución que contiene CFSE y lave las células 1x con un volumen igual de medios de cultivo.
NOTA: Las células 4T1 ahora están etiquetadas fluorescentemente. - Devuelva las células 4T1-CFSE a las condiciones de cultivo estándar en RT con 5% CO2.
5. Sembrar los macrófagos de ratón RAW 264.7 y la cocultura con 4T1
- A medida que la confluencia de RAW 264.7 alcance el 70-80%, deseche los medios de cultivo y enjuague suavemente 2x con al menos 2 ml de PBS.
- Preparar los macrófagos para la recolección desalojando suavemente las células adherentes usando un rascador de células y transferirlos a un tubo cónico de 15 ml.
- Cuente las células usando un hemocitómetro y prepare una suspensión celular de 1 x 105 células/ml diluyendo la solución restante con un medio DMEM completo según la densidad de sembración.
NOTA: Las células excesivamente confluentes en los cocultivos pueden reducir gravemente la fagocitosis. En este estudio, la proporción de semillas de macrófagos: las células cancerosas se ajustaron a una proporción de 1:1. La relación se puede ajustar dependiendo de la agresividad de las células tumorales y el origen de los macrófagos. - Antes de cocultar, deseche el sobrenadante de cultivo de las células 4T1 sembradas un día antes (paso 4.5) y lave cuidadosamente las monocapas 2x con al menos 1 mL de PBS.
- Semilla 1 x 105 RAW 264.7 células por 2 mL de medio DMEM completo en uno de los platos de imágenes 4T1. Incubar las células de 2 a 3 h a 37 oC con un 5% deCO2 para permitir la adherencia celular. Etiquete la placa de imágenes 4T1-M1 coculture.
NOTA: Las células 4T1 (control) no se cocultivaron con macrófagos.
6. Polarización M1 de los macrófagos RAW 264.7
- Preparar medios de polarización M1 añadiendo 100 ng/mL LPS y 20 ng/mL IFN-o en un medio DMEM completo complementado con 10% (v/v) FBS10,11.
- Deseche el sobrenadante de cultivo de los macrófagos incubados antes (paso 5.5) y lave cuidadosamente las monocapas en el plato 2x con al menos 1 mL de PBS.
- A continuación, añadir 2 ml de medios de polarización M1 en la placa de imágenes y permitir que las células RAW 264.7 induzcan en el fenotipo de macrófagoM 1 incubando a 37 oC con 5% de CO2.
NOTA: Las células macrófagos M1 pueden ocupar hasta 2 x 3 h de incubación para lograr una polarización completa. Es necesario realizar experimentos preliminares para garantizar el período de incubación adecuado para permitir la polarización completa de los macrófagos.
7. Microscopía de vídeo de células vivas de fagocitosis
NOTA: Hay que tener en cuenta muchos factores al realizar imágenes de células en vivo para obtener un vídeo producible, incluida la optimización de la exposición de la imagen, la medición del tiempo y la corrección automática del enfoque.
- Antes del experimento, configure la incubadora de cultivo celular encendiendo el termostato a 37 oC y suministrando un 5% de CO2.
NOTA: La configuración del microscopio requiere una etapa invertida, una incubadora de etapa superior, control de humedad (95%) y sistema de incubación de gas. Esta configuración es crucial para mantener las células para la evaluación de la microscopía de vídeo de células vivas a largo plazo. - Encienda el microscopio incluyendo la etapa piezoeléctrica y cargue el software de imágenes del microscopio.
- Coloque las células de cocultivo sembradas en una placa de imágenes con fondo de vidrio de 35 mm en el centro del escenario y atornille suavemente la cámara superior. Utilice el joystick para motorizar el escenario seleccionando la posición a crear una imagen.
- Para ver la muestra, seleccione el filtro de contraste de fase en la torreta. Después de ver inicialmente la muestra, localice los campos adecuados y ponga la muestra en el foco.
NOTA: El software de imágenes permite el uso de la selección de objetivos totalmente automatizada, el sistema de enfoque perfecto, la serie de lapso de tiempo, la adquisición de imágenes multicanal y la adquisición de imágenes multipunto. - Para configurar la fluorescencia multicanal para el etiquetado CFSE y la adquisición de contraste de interferencia diferencial, abra el cuadro de diálogo de adquisición de software de imágenes y seleccione la casilla de verificación de la ficha [Lambda] (Figura 2).
NOTA: Para una toma de imágenes de lapso de tiempo de 13 horas, se debe utilizar un canal de contraste de fase. - Seleccione la pestaña [Lambda] ( Lambda) [Configuración óptica] y seleccione [10X DIC] para el contraste de interferencia diferencial y [GFP-R] para la casilla de verificación del filtro de fluorescencia verde. Bajo el [Lambda] [Enfoque], seleccione la casilla de verificación [10X DIC] para establecer como referencia de enfoque.
- Abra el cuadro de diálogo de adquisición de software de imágenes y haga clic en el botón [Tiempo XYZ ...] y seleccione la ficha [XY].
- Muévase al punto de adquisición de la imagen utilizando el joystick en el escenario motorizado mientras comprueba la imagen en vivo o seleccione una posición diferente a través de los oculares. A continuación, haga clic en la casilla de verificación debajo de la columna [Nombre de punto] para establecer cada punto en cada ubicación para la captura de imágenes (consulte la figura 3).
NOTA: La etapa automatizada permite la adquisición de imágenes multipunto de diferentes coordenadas XY para capturar varios campos. - Ajuste el enfoque de cada muestra vista en la pantalla. Utilice los controles de Corrección de enfoque automático.
- Utilice el software para configurar la captura de imágenes de lapso de tiempo. En el cuadro de diálogo Adquisición de software de imágenes, marque la ficha [Tiempo] (consulte la figura 4).
- Determine el [Intervalo] (el retraso entre el principio de un punto de tiempo a otro punto de tiempo) y [Duración] (la duración total del experimento). Las unidades de tiempo varían y se pueden seleccionar en milisegundos (ms), segundos (s), minutos (m) u horas (h) en el menú desplegable.
NOTA: La duración del período de diagnóstico por imágenes para las imágenes de lapso de tiempo de fluorescencia y la adquisición multicanal de lapso de tiempo DIC puede variar en función del colorfluorescente utilizado en este ensayo. El fotoblanqueo puede ocurrir si las células etiquetadas están expuestas durante demasiado tiempo. - Marque la casilla de verificación [Guardar en archivo] para guardar las imágenes adquiridas. En la ficha [Programación de tiempo], haga clic en el botón [Ejecutar ahora] para adquirir imágenes de series temporales multipunto (consulte la figura 5).
NOTA: En el software de imágenes, las imágenes se guardan en formato de archivo nd2. Cada lapso de tiempo se puede guardar individualmente en un formato de archivo MP4 más adelante.
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Resultados
Las imágenes bidimensionales (2D) del modelo de cocultivo de las líneas celulares del carcinoma mamario 4T1 muestran las células 4T1 que están siendo engullidas por los macrófagos M1 durante un período de 13 h. Es importante asegurar una polarización completa de los macrófagos M1 mediante la realización de inmunomanchas. Los resultados(Figura 1) muestran que la concentración de 100 ng/ml lipopolisacáridos (LPS) y 20 ng/ml IFN-o polarizó los macrófagos RAW 264.7 en el estado M1. Etiquetar las...
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Discusión
El protocolo descrito requiere dos pasos: 1) cocultivo de células de carcinoma mamario de ratón 4T1 y macrófagos polarizados M1, y 2) evaluación de la actividad fagocítica de macrófagos mediante microscopía de lapso de tiempo. La cocultura de células vivas se utiliza ampliamente en fagocitosis y ensayos de migración. El modelo de cocultivo de células vivas aquí es un procedimiento in vitro simple y adaptable(Figura 2)que utiliza un tinte fluorescente, CFSE, que se utiliza para etiquetar las ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado financieramente por Geran Putra Berimpak (GBP), La Universiti Putra Malasia: 9542800. Nos gustaría dar las gracias al Instituto Agrobiotecnología, a los laboratorios de Malasia (ABI) y a la instalación de imágenes de microscopía. Un agradecimiento especial a Mohd Daniel Hazim por ayudar en la edición y grabación del vídeo experimental para este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo anti-INOS conjugado FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 y micro; g en 1 mL |
| Carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/alta glucosa | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Suero fetal bovino | Tico Europe | FBSEU500 500 mL | |
| Lipopolisacáridos | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Ratón recombinante interferón-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µ g |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Solución salina tamponada con fosfato | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 paquete |
| de tripsina EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µ Puntas de pipeta L | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 puntas/caja |
| 2 mL pipeta serológica | JET BIOFIL | GSP012002 | No pirogénica |
| 200 y micro; L puntas de pipeta | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20.000 tps/caja |
| Matraz de cultivo celular de 25 cm2 | Corning | CLS430639 Cultivo de tejidos tratado | |
| Centrífuga de sobremesa | Dynamica | FA15C | Modelo: Velocity 14R |
| Campana de seguridad biológica | Nuaire | NU-565-400 | Modelo: Inicio/ LabGard® ES TE NU-565 Clase II, Tipo B2 Campana de bioseguridad Mezclador |
| CO2/aire | Chamlide (Instrumento de célula viva) | FC-R-20 | FC-5 (Mezclador de CO2/aire) con el caudalímetro |
| Raspador de celdas | NEST | 710001 | Incubadora |
| células de CO2 | Panasonic | N/A | Modelo: MCO-19M(UV) |
| Microscopio confocal | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Antena parabólica con fondo de cristal | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Disponible descarga en línea | |
| Controlador | pipetas CappAid | PA-100 | CappController controlador de pipetas, 0.1-100ml |
| Termostato | Shinko | Descatalogado | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
