En este estudio se tomó la imagen de la actividad fagocítica de macrófagos contra las células cancerosas, específicamente las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. El modelo de cocultivo de células vivas se estableció y observó utilizando una combinación de microscopía de contraste de interferencia fluorescente y diferencial. Esta evaluación se realizó utilizando un software de imágenes para desarrollar vídeo de lapso de tiempo multipunto.
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Artículo de método
Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos asociados a tumores (AMA) se han identificado como un componente importante para el crecimiento tumoral, la invasión, la metástasis y la resistencia a las terapias oncológicas. Sin embargo, los macrófagos asociados al tumor pueden ser perjudiciales para el tumor dependiendo del microambiente tumoral y pueden alterar de forma reversible sus características fenotípicas mediante la antagonización de la actividad citotóxica de las células inmunitarias o mejorando la respuesta antitumoral. Las acciones moleculares de los macrófagos y sus interacciones con las células tumorales (p. ej., fagocitosis) no se han estudiado ampliamente. Por lo tanto, la interacción entre las células inmunitarias (Tam de subtipo M1/M2) y las células cancerosas en el microambiente tumoral es ahora un foco de investigación de inmunoterapia contra el cáncer. En el presente estudio, se desarrolló un modelo de cocultivo de células vivas de macrófagos M1 inducidos y células de carcinoma 4T1 mamaria de ratón para evaluar la actividad fagocítica de los macrófagos utilizando una función de vídeo de lapso de tiempo utilizando la microscopía de contraste de fase, fluorescente y contraste de interferencia diferencial (DIC). El método actual puede observar y documentar imágenes multipunto de células vivas de fagocitosis. La fagocitosis de células 4T1 por macrófagos M1 se puede observar mediante microscopía fluorescente antes de manchar las células 4T1 con éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE). La publicación actual describe cómo coculturar macrófagos y células tumorales en una sola placa de diagnóstico por imágenes, polarizar los macrófagos M1 y registrar eventos multipunto de macrófagos que envuelven células 4T1 durante 13 h de cocultura.
Introducción
Los macrófagos son la primera línea de defensa inmune y desempeñan un papel en la orquestación de respuestas inmunitarias contra patógenos y materiales extraños, incluidas las células cancerosas. Son un fagocito especializado que destruye y elimina las partículas no deseadas en el cuerpo. Los macrófagos aportan funciones defensivas como el aclaramiento de células apoptoticas y microorganismos y el reclutamiento de otras células inmunitarias1. Los macrófagos pueden diferenciarse en dos tipos diferentes, los macrófagos M1 y M2, en respuesta a las señales ambientales2. Los macrófagos polarizados en M1 (es decir, los macrófa....
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Protocolo
NOTA: Las secciones 1-6 describen el modelo de cocultivo de las células de carcinoma mamario del ratón 4T1 y los macrófagos de ratón RAW 264.7. La sección 7 describe la evaluación del lapso de tiempo de las células 4T1 fagoyted de los macrófagos M1.
1. Culturing 4T1 células de carcinoma mamario de ratón y macrófagos de ratón RAW 264.7
- Descongelar un vial de 4T1 y RAW 264.7 conservado sofocar 4T1 y RAW 264.7 pasar 6 células por agitación suave en un baño de agua a 37 oC o la temperatura de crecimiento normal para las líneas celulares.
NOTA: La descongelación debe hacerse rápidamente, aproximadamente en un plazo de 2 minutos. Par....
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Resultados
Las imágenes bidimensionales (2D) del modelo de cocultivo de las líneas celulares del carcinoma mamario 4T1 muestran las células 4T1 que están siendo engullidas por los macrófagos M1 durante un período de 13 h. Es importante asegurar una polarización completa de los macrófagos M1 mediante la realización de inmunomanchas. Los resultados(Figura 1) muestran que la concentración de 100 ng/ml lipopolisacáridos (LPS) y 20 ng/ml IFN-o polarizó los macrófagos RAW 264.7 en el estado M1. Etiquetar las.......
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Discusión
El protocolo descrito requiere dos pasos: 1) cocultivo de células de carcinoma mamario de ratón 4T1 y macrófagos polarizados M1, y 2) evaluación de la actividad fagocítica de macrófagos mediante microscopía de lapso de tiempo. La cocultura de células vivas se utiliza ampliamente en fagocitosis y ensayos de migración. El modelo de cocultivo de células vivas aquí es un procedimiento in vitro simple y adaptable(Figura 2)que utiliza un tinte fluorescente, CFSE, que se utiliza para etiquetar las .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado financieramente por Geran Putra Berimpak (GBP), La Universiti Putra Malasia: 9542800. Nos gustaría dar las gracias al Instituto Agrobiotecnología, a los laboratorios de Malasia (ABI) y a la instalación de imágenes de microscopía. Un agradecimiento especial a Mohd Daniel Hazim por ayudar en la edición y grabación del vídeo experimental para este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Anticuerpo anti-INOS conjugado FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 y micro; g en 1 mL |
| Carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/alta glucosa | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Suero fetal bovino | Tico Europe | FBSEU500 500 mL | |
| Lipopolisacáridos | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Ratón recombinante interferón-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µ g |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Solución salina tamponada con fosfato | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 paquete |
| de tripsina EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µ Puntas de pipeta L | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 puntas/caja |
| 2 mL pipeta serológica | JET BIOFIL | GSP012002 | No pirogénica |
| 200 y micro; L puntas de pipeta | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20.000 tps/caja |
| Matraz de cultivo celular de 25 cm2 | Corning | CLS430639 Cultivo de tejidos tratado | |
| Centrífuga de sobremesa | Dynamica | FA15C | Modelo: Velocity 14R |
| Campana de seguridad biológica | Nuaire | NU-565-400 | Modelo: Inicio/ LabGard® ES TE NU-565 Clase II, Tipo B2 Campana de bioseguridad Mezclador |
| CO2/aire | Chamlide (Instrumento de célula viva) | FC-R-20 | FC-5 (Mezclador de CO2/aire) con el caudalímetro |
| Raspador de celdas | NEST | 710001 | Incubadora |
| células de CO2 | Panasonic | N/A | Modelo: MCO-19M(UV) |
| Microscopio confocal | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Antena parabólica con fondo de cristal | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Disponible descarga en línea | |
| Controlador | pipetas CappAid | PA-100 | CappController controlador de pipetas, 0.1-100ml |
| Termostato | Shinko | Descatalogado | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
Referencias
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A.
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Reimpresiones y permisos
