Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Resumen

Aquí, describimos el método que empleamos para crear imágenes de filopodia dendrítica altamente móviles en una preparación en vivo del cerebro larvario Drosophila, y el protocolo que desarrollamos para cuantificar conjuntos de datos de imágenes 3D de lapso de tiempo para evaluaciones cuantitativas de la dendrita dinámica en el desarrollo de neuronas.

Resumen

Filopodia dendrítica altamente móvil están ampliamente presentes en las neuronas en las primeras etapas del desarrollo. Estas ramas dinámicas exploratorias muestrean el entorno circundante e inician contactos con posibles socios sinápticos. Aunque la conexión entre la dinámica de las ramas dendríticas y la sinaptogénesis está bien establecida, no se entiende bien cómo los procesos de desarrollo y dependientes de la actividad regulan la dinámica de las ramas dendríticas. Esto se debe en parte a las dificultades técnicas asociadas con las imágenes en vivo y los análisis cuantitativos de estas estructuras finas utilizando un sistema in vivo. Establecimos un método para estudiar la dinámica de la dendrita utilizando las neuronas laterales ventrales larvales de Drosophila (LNvs), que pueden ser etiquetados individualmente utilizando enfoques genéticos y son accesibles para imágenes en vivo. Aprovechando este sistema, desarrollamos protocolos para capturar la dinámica de ramas de todo el árbol dendrítico de un solo LNv etiquetado a través de imágenes en vivo de lapso de tiempo. A continuación, realizamos el postprocesamiento para mejorar la calidad de la imagen a través de la corrección de deriva y la desconvolución, seguido de analizar la dinámica de las ramas a nivel de una sola rama mediante la annotación de las posiciones espaciales de todos los terminales de rama. Por último, hemos desarrollado scripts R(Archivo complementario)y parámetros específicos para cuantificar la dinámica de las ramas utilizando la información de coordenadas generada por el seguimiento del terminal. Colectivamente, este protocolo nos permite lograr una descripción cuantitativa detallada de la dinámica de las ramas del árbol dendrítico neuronal con alta resolución temporal y espacial. Los métodos que desarrollamos son generalmente aplicables a las neuronas escasamente etiquetadas en condiciones in vitro e in vivo.

Introducción

Las dendritas son compartimentos neuronales especializados que reciben y procesan la entrada sensorial y sináptica. La compleja y estereotipada estructura de los árboles dendríticos ha estado bajo intensa investigación desde su descubrimiento. Se han establecido varios sistemas modelo, incluidas las neuronas tectales ópticas Xenopus, las células ganglionares de la retina de los polluelos y la arborización dendrítica (da) en el sistema Drosophila, para estudiar el desarrollo, la remodelación y la plasticidad de Dendritas neuronales^1,2,3,

Protocolo

PRECAUCION: Este protocolo implica el uso de láseres de clase IV y requerirá que se sigan las pautas adecuadas de capacitación y seguridad. Evite la exposición de los ojos o la piel a la luz láser directa o dispersa.
NOTA: El protocolo incluye seis pasos. El flujo de trabajo se muestra en la Figura 1A.

1. Etiquetado de neuronas individuales mediante la técnica flip-out

NOTA: El etiquetado único de LNvs se logra expresando mCD8::GFP en LNvs individual usando etiquetado estocástico mediado por flippasa. El genotipo de....

Resultados

Utilizando el protocolo de imágenes en vivo descrito anteriormente, capturamos pilas de imágenes de alta resolución para los análisis y cuantificación posteriores. El vídeo suplementario 1 muestra la serie de imágenes proyectadas de intensidad máxima (MIP) recopiladas de un representante etiquetado individualmente LNv. La Figura 2B muestra el montaje correspondiente de ocho fotogramas de la serie de imágenes. En ambos paneles.......

Discusión

Aquí, describimos un protocolo que desarrollamos para registrar y cuantificar el comportamiento dinámico de las ramas dendríticas en neuronas etiquetadas individualmente en cerebros larvarios Drosophila. En particular, nuestro protocolo de imágenes en vivo contiene parámetros específicos que nos permiten capturar todo el árbol dendrítico de un LNv larvario y proporcionar una visión global del estado dinámico de sus ramas dendrita. Sin embargo, debido a que nuestros métodos de cuantificación dependen en gran medi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Láser multifotónico Chameleon Vision II	Grasa
alto vacío	Dow Corning	79751-30
LSM 780 microscopio confocal de barrido láser de dos fotones	Carl Zeiss		configuración vertical
Microscopio Cubierta de vidrio	Fisher Scientific	12-544-E
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
Software
		imágenes
reactivos > fuerte
HEPES
KCl
MgCl2
NaCl
NaHCO3
PBS
Sacarosa
TES