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Artículo de método

Aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados

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DOI:

10.3791/60291

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12 de enero de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es aislar los microvasculares de múltiples regiones del sistema nervioso central de vertebrados lisencéfalos y gyrencéfalos.

Resumen

El aislamiento de los microvasculares del sistema nervioso central (SNC) se realiza comúnmente mediante la combinación de tejido cortical de múltiples animales, la mayoría de las veces roedores. Este enfoque limita el interrogatorio de las propiedades de la barrera hematoencefálica (BBB) a la corteza y no permite la comparación individual. Este proyecto se centra en el desarrollo de un método de aislamiento que permite la comparación de la unidad neurovascular (NVU) de múltiples regiones del SNC: corteza, cerebelo, lóbulo óptico, hipotálamo, hipófisis, tronco encefálico y médula espinal. Además, este protocolo, desarrollado originalmente para muestras murinas, fue adaptado con éxito para su uso en tejidos del SNC de especies de vertebrados pequeños y grandes de los que también somos capaces de aislar microvas de la materia blanca del hemisferio cerebral. Este método, cuando se combina con inmunoetiquetado, permite la cuantificación de la expresión de proteínas y la comparación estadística entre individuos, tipo de tejido o tratamiento. Demostramos esta aplicabilidad evaluando los cambios en la expresión de proteínas durante la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo murino de una enfermedad neuroinflamatoria, esclerosis múltiple. Además, los microbuques aislados por este método podrían utilizarse para aplicaciones posteriores como qPCR, RNA-seq y Western blot, entre otros. Aunque este no es el primer intento de aislar los microrridos del SNC sin el uso de ultracentrifugación o disociación enzimática, es único en su adecuación para la comparación de individuos individuales y múltiples regiones del SNC. Por lo tanto, permite la investigación de una gama de diferencias que de otro modo pueden permanecer oscuras: porciones del SNC (córtex, cerebelo, lóbulo óptico, tronco encefálico, hipotálamo, hipófisis y médula espinal), tipo de tejido del SNC (materia gris o blanca), individuos, grupos de tratamiento experimental, y las especies.

Introducción

Nuestro cerebro es el órgano más importante de nuestro cuerpo. Por esta razón, mantener la homeostasis cerebral a pesar de factores externos que pueden desencadenar una desviación de la normalidad es una prioridad. Según algunos eruditos, hace unos 400-500 millones de años1, los animales vertebrados desarrollaron lo que ahora conocemos como la barrera hematoencefálica (BBB)2,3. Esta "cerca" protectora ejerce la mayor influencia sobre la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) y funciona regulando estrechamente el transporte de iones, moléculas y células entre la sangre y el parénquima del SNC. Cuando el BBB se interrumpe, el cerebro se vuelve susceptible a la exposición tóxica, infección, y la inflamación. Por lo tanto, la disfunción BBB se asocia con muchos, si no todos, trastornos neurológicos y neurodesarrollo4,5,6.

La sofisticada función del BBB se atribuye a la microvasculatura única del SNC conformada por la unidad neurovascular (NVU)2,3. Células endoteliales altamente especializadas, pericitas y pies de punta astrocíticos son los componentes celulares de la NVU2,3. La matriz extracelular generada por estas células también es esencial para la fisiología NVU y BBB2,3. Aunque los componentes celulares y moleculares esenciales de la NVU se conservan entre los vertebrados, la heterogeneidad se reporta entre las órdenes y las especies7,8. Sin embargo, las limitaciones técnicas impiden nuestra capacidad de considerar plenamente estas diferencias en la neurobiología, la investigación biomédica o traslacional.

Debido a esto, ampliamos un método de aislamiento de microbuques específico de la región del SNC para hacerlo aplicable a numerosas especies de los cinco grupos de vertebrados: peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos. El protocolo se describe para su uso en vertebrados lisencéfalos y grandes, incluidas las especies con relevancia traslacional9. Además, incluimos otras regiones del SNC no investigadas antes en este contexto, pero relevantes para la neurofisiología y con tremendas implicaciones clínicas: el hipotálamo, la hipófisis y la materia blanca. Por último, probamos la capacidad de este método de aislamiento como una herramienta fiable para identificar cambios en la expresión proteica a lo largo de la NVU y/o BBB9,10,11. Como prueba de concepto, mostramos cómo determinar los cambios en la expresión VCAM-1 y JAM-B durante EAE utilizando el método de aislamiento seguido de inmunofluorescencia.

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Protocolo

Todos los procedimientos del presente estudio están de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California (UC). El cuidado de animales en UC Davis está regulado por varios recursos independientes y ha sido totalmente acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC) desde 1966. Los tejidos del SNC porcino se obtuvieron del Departamento de Ciencias Animales de la UCD, Laboratorio de Ciencias de la Carne. Los tejidos del SNC de los macacos de rhesus se obtuvieron del Departamento Nacional de Patología del Centro Nacional de Investigación de Primates de California (NIH P51OD011107). El personal del laboratorio no realizó anestesia, eutanasia ni necropsia en cerdos y macacos. Por lo tanto, no hay recomendaciones particulares sobre estas cuestiones.

NOTA: Este método fue validado para múltiples especies, pero el protocolo proporcionado corresponde más directamente a los tejidos de ratón y porcino. Los detalles relativos al lóbulo óptico no se aplican cuando se utilizan especímenes de mamíferos. Todos los materiales biopeligrosos deben manipularse en una instalación adecuada para el nivel de bioseguridad (BSL). Todos los materiales agudamente tóxicos deben manipularse debajo de una campana de humos. Todos los residuos médicos biopeligrosos y los residuos tóxicos agudos deben eliminarse adecuadamente.

1. Preparación

  1. Preparar soluciones (Tabla 1) con al menos un día de antelación.
    NOTA: Es muy difícil disolver 70 kDa de peso molecular (MW) dextran. Es más eficiente dejar que la solución se revuelva durante la noche cubierta con película de parafina o papel de aluminio. El protocolo requiere el uso de dos soluciones MV-2 diferentes dependiendo de la muestra bajo investigación. El 18% dextran separa eficientemente la mielina del pellet de microvas al realizar el protocolo en pequeñas muestras lissencéfalas. Sin embargo, desarrolla un frotis de mielina dentro de la interfaz de los tejidos del SNC a partir de grandes muestras gyrencéfalos, así como el hipotálamo y la hipófisis de pequeños especímenes. Este frotis se previene mediante el uso de 20% dextran.
  2. Preparar los toboganes bien cargando 50 ml por pozo de poli-D-lisina y dejar secar durante 2 horas a temperatura ambiente (RT), preferiblemente en un armario de seguridad biológica de clase 2 (BSC-2). No se seque demasiado. Enjuague dos veces con solución salina con fosfato (PBS) y guárdela en el refrigerador hasta que esté lista para usar.

2. Disección de tejido del SNC del espécimen de vertebrado lisencéfalo pequeño

NOTA: El artículo muestra la aplicación del protocolo en un Ratón macho C57BL6/J, de 10 semanas de edad, 25 g.

  1. Preparar dos tubos cónicos de 15 ml y un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con 5 ml y 1 ml, respectivamente, de solución MV-1 por muestra. Mantenga los tubos en el hielo.
  2. Anestesia
    1. Anestetizar ratones por inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina, xilazina y anestésico de acepromaz a 100/10/3 mg por kg de peso corporal y rociar con 70% de etanol. Confirme la anestesia evaluando la ausencia de reflejos palpebrales y de pedales tocando un ojo y pellizcando un pie, respectivamente.
    2. Anestetizar palomas por inhalación de 5% isoflurano utilizando una caja de anestesia de inducción.
    3. Anestetizar peces y ranas en 1% Tricaína en un tanque de agua de pescado o solución de Anfibio Ringer(Tabla de Materiales),respectivamente.
    4. Anestetiza los lagartos enfriándose a 4oC antes de la eutanasia.
  3. Decapitar al animal con tijeras quirúrgicas, pelar la piel con fórceps para exponer el cráneo, y cortar con tijeras LaGrange a través del foramen magnum (Figura 1A).
  4. Diseccionar el cerebro con una espátula y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.
  5. Recuperar la hipófisis de la sella turcica del cráneo con fórceps y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.
  6. Retire la piel y el músculo para exponer la columna vertebral. Cortar las extremidades, la caja torácica y los órganos internos(Figura 1B).
  7. Diseccionar la médula espinal por uno de los dos métodos descritos a continuación. A continuación, transfiera a un tubo cónico de 5 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.
    1. Realizar laminectomía cortando en una dirección rostral a caudal con tijeras LaGrange, comenzando a través del foramen vertebralcervical, hasta llegar al cordón lumbar.
    2. Realizar el lavado en una dirección caudal a rostral a lo largo del foramen vertebral lumbar con una aguja de 18 G y una jeringa de 10 ml cargada con solución MV-1(Figura 1C,D).
      NOTA: Este método sólo funciona con especímenes muy pequeños, en su mayoría roedores (<100 g).
  8. Usando un endoscopio, corte el saco dural de la médula espinal con tijeras de resorte y retire las meninges restantes con un pico de doble punta(Figura 2).
  9. Transfiera el cerebro a una placa de Petri y, usando un endoscopio de diselación, retire las meninges con un pico de doble punta(Figura 2A–C).
  10. Exijo los bulbos olfativos y el tálamo con fórceps, tijeras de iris y tijeras de resorte. Usando la selección de doble punta, retire el plexo coroides de todos los ventrículos cerebrales. Asegúrese de quitar todo el plexo coroides.
    NOTA: El plexo coroideo y las bombillas olfativas son una fuente masiva de contaminación. A diferencia del BBB, estos capilares están altamente fenestrados y los resultados de los experimentos posteriores se verán comprometidos si no se eliminan.
  11. Usando fórceps, separe las distintas regiones del SNC: corteza, cerebelo, tronco encefálico, lóbulo óptico (no en muestras de mamíferos) e hipotálamo.

3. Disección de tejido del SNC de un espécimen de vertebrado gyrencéfalo grande

NOTA: Este protocolo utiliza tejidos del SNC porcinos obtenidos de un matadero. Por lo tanto, no se describe ni muestra anestesia, eutanasia o necropsia aquí.

  1. Transporte los tejidos del SNC porcino en un recipiente de histología de 0,946 L (32 oz) cargado con solución MV-1 dentro de un cofre de hielo/cubo.
  2. Usando un endoscopio, retire las meninges con un pico de doble punta, fórceps, tijeras de iris y tijeras de resorte de cada tejido del SNC. Asegúrese de eliminar cualquier pedazo del plexo coroides de los ventrículos cerebrales.

4. Homogeneización del tejido del SNC

NOTA: Es más eficiente cuando dos investigadores participan en el proceso de homogeneización: uno disecing las meninges bajo el estereoscopio y el otro homogeneizar los tejidos picados. De esta manera, los tejidos se devuelven rápidamente al cubo de hielo y se mantienen fríos.

  1. Coloque cada región de CNS en una placa Petri con solución MV-1 de 1 ml de solución. Usando una hoja de un solo borde, pique el tejido para obtener piezas de 1-2 mm.
    1. Para una pequeña muestra de vertebrados, utilice una placa Petri de 100 mm x 20 mm.
    2. Para una muestra de vertebrado grande, utilice una placa Petri de 150 mm x 15 mm.
  2. Homogeneización de un pequeño espécimen vertebrado(Tabla 2 y Tabla 3)
    1. Transfiera la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y la médula espinal a 1 ml de solución MV-1 en una trituradora individual de tejido de vidrio Potter-Elvehjem de 10 ml con una plaga de PTFE utilizando una pipeta de transferencia. Añadir 5 ml de solución MV-1 y homogeneizar cada tejido (10 golpes). Traslado a tubos cónicos individuales de 15 ml. Mantenga los tubos en el hielo.
      NOTA: Para un vertebrado pequeño, 5 o 4, con o sin lóbulo óptico, respectivamente, se necesitan 10 mL de amoladoras Potter-Elvehjem y tubos cónicos de 15 ml.
    2. Transfiera el hipotálamo y la hipófisis con fórceps a 100 l de solución MV-1 en un tubo individual de 1,7 ml y homogeneice cuidadosamente con un micropsto de vidrio. Enjuague cada micropstel con 1 ml de solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.
      NOTA: Para un vertebrado pequeño, se necesitan 2 microplagas de vidrio y tubos de 1,7 ml.
  3. Homogeneización de un espécimen de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5)
    1. Usando una pipeta de transferencia, transfiera el tejido picado a una trituradora de tejido de vidrio Potter-Elvehjem de 55 ml con un pestillo de PTFE y adjúntelo al agitador superior. Añadir la mitad del volumen recomendado de la solución MV-1, de acuerdo con la parte específica del SNC que se está homogeneiparando(Tabla 5).
    2. Encienda el agitador superior a muy baja velocidad (150 rpm) y mueva cuidadosamente el tubo de vidrio hacia arriba y hacia abajo durante unos 30 s.
    3. Apague el agitador superior, agregue más solución MV-1 y repita el paso 4.3.2 hasta obtener una suspensión homogénea.
    4. Traslado a un tubo cónico de 50 ml. Mantenga el tubo en el hielo.
    5. Lave la amoladora con agua desionizada entre cada homogeneización del tejido del SNC.
      NOTA: Para un vertebrado grande 5 o 4, con o sin materia blanca, respectivamente, se necesitan tubos cónicos de 50 ml. Del mismo modo, se necesitan dos (2) tubos cónicos de 15 ml para el hipotálamo y la hipófisis.

5. Purificación de microvasos

  1. El tejido centrífugo se homogeneiza resultante de los pasos 4.2.1, 4.2.2 o 4.3.4 a 2.000 x g durante 10 min a 4oC. Una gran interfaz blanca de mielina se formará en la parte superior de los pellets de los microvasos rojizos. Descarta los supernatantes.
    1. Espécimen de vertebrados pequeños(Tabla 2 y Tabla 3)
      1. Resuspenda la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y los gránulos de la médula espinal en 5 ml de solución MV-2 helada con una pipeta serológica de 5 ml (10 rubores). Añadir 5 ml de solución MV-2 helada a cada suspensión y mezclar cuidadosamente girando los tubos.
      2. Resuspender el hipotálamo y los pellets pituitaria con 1 ml de solución MV-2.
    2. Espécimen de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5)
      1. Agregue 20 ml de solución MV-2 helada a la corteza, el cerebelo, el tronco encerefálico y los gránulos de microvasola de la médula espinal. Resuspende los pellets mezclando en un agitador de revólver de tubo, revolviendo a 40 rpm durante 5 minutos.
      2. Resuspenda el hipotálamo y los gránulos de microvasos pituitarioes en 5 ml de solución MV-2 con una pipeta serológica de 5 ml (10 rubores). Añadir 5 ml de solución MV-2 helada a las suspensiones y mezclar cuidadosamente girando el tubo.
  2. Centrífuga a 4.400 x g durante 15 min a 4oC.
  3. Separe cuidadosamente la gruesa y densa capa de mielina en la interfaz líquida de las paredes de cada tubo girando lentamente los tubos y permitiendo que el sobrenadante pase a lo largo de las paredes.
  4. Deseche la interfaz de mielina y líquido y borre la pared interior de cada tubo con una espátula envuelta con una toallita de papel de baja pelusa. Para muestras de vertebrados pequeños, retire la capa de mielina de cada hipotálamo y tubo pituitario succionando cuidadosamente con una pipeta de transferencia.
  5. Limpie el exceso de líquido con una toallita de papel retorcida con poca pelusa. Resuspenda cada pellet con 1 ml de solución MV-3 utilizando puntas de baja unión. Mantenga los tubos en el hielo.

6. Elución y filtración de microvesseles

  1. Vierta la solución MV-3 helada en vasos individuales para cada región del SNC. Manténgase a 4oC.
    1. Para muestras de vertebrados pequeños, utilice 10 ml de solución MV-3 por vaso de precipitados de 50 ml. Un total de 6-7 vasos es necesario dependiendo de si el lóbulo óptico está incluido o no.
    2. Para muestras de vertebrados grandes, utilice 30 ml de solución MV-3 por vaso de precipitados de 100 ml. Un total de 6-7 vasos es necesario dependiendo de si se incluye o no la materia blanca.
  2. Coloque un colador de células encima de un tubo cónico de 50 ml. Utilice uno por región cns. Utilice un colador de 100 m para la corteza, el tronco encefálico, el lóbulo óptico, la médula espinal y la hipófisis. Utilice un colador de células de 70 m para el cerebelo y el hipotálamo.
  3. Humedezca cada colador con 1 ml de solución MV-3 helada.
  4. Añadir más solución MV-3 a las suspensiones preparadas en el paso 5.5 con una pipeta serológica mientras se mezcla para evitar agregados. Cargue cuidadosamente los microvasos en la parte superior del colador. Enjuague con solución MV-3 helada.
    1. Para pequeños muestras de vertebrados(Tabla 2 y Tabla 3),añadir 10–15 ml de solución MV-3 con una pipeta serológica y enjuagar con 5 ml de solución MV-3.
    2. Para muestras de vertebrados grandes, agregue 20 ml de solución MV-3 con una pipeta serológica y enjuague con 10 ml de solución MV-3.
  5. Montar la unidad de filtración colocando un filtro de red de nylon de 20 m en un soporte de filtro modificado(Figura 2D),uno por región CNS.
    1. Para muestras de vertebrados pequeños(Tabla 2 y Tabla 3),utilice soportes de filtro modificados de 25 mm para la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y la médula espinal. Utilice soportes de filtro modificados de 13 mm para el hipotálamo y la hipófisis.
    2. Para muestras de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5),utilice soportes de filtro modificados de 47 mm para la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal. Utilice 25 mm para el hipotálamo y la hipófisis.
  6. Coloque el filtro en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y un filtro húmedo con 5 ml de solución MV-3 helada, asegurándose de que el tampón vierta por el soporte del filtro hasta el tubo cónico.
  7. Transfiera los microvasos eludados (del paso 6.4) en la parte superior del filtro de red de nylon de 20 m y enjuague los microrecipientes con 5-10 ml de solución MV-3 helada.
  8. Recupere el filtro con fórceps limpios y sumerjalo en el vaso de precipitados que contiene la solución MV-3 helada preparada en el paso 6.1.
  9. Separe los microrecipientes del filtro sacudiéndolo suavemente durante unos 30 s. Para pequeños especímenes de vertebrados, vierta el contenido del vaso de precipitados en un tubo cónico de 15 ml. Para muestras de vertebrados grandes, vierta el contenido del vaso de precipitados en un tubo cónico de 50 ml.
  10. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min a 4 oC y resuspender el pellet en 1 ml de solución MV-3 helada con una punta de pipeta de baja unión.
    1. Para muestras de vertebrados pequeños, transfiera la suspensión (del paso 6.10) a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml y centrífuga a 20.000 x g durante 5 min a 4 oC.
      NOTA: Este giro se realiza en una centrífuga de sobremesa a máxima velocidad (20.000 x g)para garantizar un rendimiento robusto.
    2. Para muestras de vertebrados grandes, transfiera la suspensión del paso 6.10 a un tubo de microcentrífuga de 5,0 ml, añada 4 ml de solución MV-3 y centrífuga a 2.000 x g durante 5 min a 4 oC.

7. Inmunomanchación

NOTA: La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se realizó en reptiles, anfibios y especímenes de peces como prueba de concepto de la viabilidad del protocolo. Por lo tanto, no hay ninguna recomendación para el inmunoetiquetado de estos especímenes.

  1. Retire el sobrenadante de los tubos de microcentrífuga.
  2. Resuspenda el pellet en 1 PBS estéril usando una punta de pipeta de baja unión(Tabla de Materiales). Evitar que los microvasos formen agregados pipeteando varias veces. Para muestras de vertebrados pequeños(Tabla 3),utilice de 100 a 2.000 ol de acuerdo con el tamaño del pellet. Para especímenes de vertebrados grandes(Tabla 5),utilice de 1.000 a 4.000 l de acuerdo con el tamaño del pellet.
  3. Usando una punta de pipeta de baja unión, transfiera los microvas a diapositivas de pozo, teniendo cuidado de agregarlos al centro de cada pocal, evitando las paredes laterales.
  4. Ajuste las diapositivas del pozo, descubiertas, dentro de un BSC-2, y deje secar durante 20 a 30 minutos en RT.
    NOTA: Se utiliza un volumen relativamente alto de 1x PBS para evitar la formación de agregados. Debido a esto, es necesario dejar que las diapositivas se sequen antes de la fijación para asegurarse de que los microrecipientes están siendo sostenidos por el recubrimiento de poli-D-lisina.
  5. Retire el PBS residual 1x pipeteando con una pipeta de transferencia, agregue 200 éL de 4% de paraformaldehído (PFA) e incubar durante 30 minutos en RT.
  6. Pipetear la solución fijativa y lavar 3x con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT.
    NOTA: En este punto se realizaron manchas de H&E en microvas de sNC de pescado, anfibios y reptiles.
  7. Añadir 200 s de tampón de bloqueo a la diapositiva del pozo e incubar durante 60 min a 37 oC.
  8. Retire el tampón de bloqueo con una pipeta de transferencia y añada 200 ml del cóctel de anticuerpos primarios en diluyente de anticuerpos(Tabla de materiales). Incubar a 4oC durante la noche.
  9. Pipetear el cóctel primario de anticuerpos y lavar 3 veces con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT.
  10. Cargar el cóctel secundario de anticuerpos(Tabla de Materiales)diluido en 1x PBS e incubar durante 2 h a RT, protegido de la luz.
  11. Pipetear el cóctel secundario de anticuerpos y lavar 3 veces con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT, protegido de la luz. Después del último lavado, desenganche el marco del well-slide y seque cualquier exceso de 1x PBS con una toallita de papel de pelusa baja.
  12. Agregue un soporte de montaje antidescolora líquido y un medio de montaje antidescolora líquido de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) para la tinción nuclear. Dejar secar durante la noche en RT protegido de la luz.
  13. Una vez seco, manténgase protegido de la luz en una caja deslizante a 4 oC hasta que esté listo para la microscopía confocal y la adquisición de datos.

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Resultados

Los microvasos aislados del SNC murino mostraron todos los componentes celulares intrínsecos de la unidad neurovascular2,3. Usando molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM, también conocida como CD31) o isolctina IB4 (una glicoproteína que une la célula endotelial glicocalyx) para células endoteliales, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) o antígeno de la neurona-glial 2 (NG2) para peric...

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Discusión

El BBB incluye las propiedades únicas de las células endoteliales de microvasculatura cerebral del cerebro acopladas por una sofisticada arquitectura de uniones estrechas, adheridas, "peg-socket", y placas de adhesión críticas para la homeostasisdelSNC2,3,19. Las propiedades de las células endoteliales son inducidas y mantenidas por pericitos y los procesos de pie final de la astroglia circundante2,<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El Dr. Cruz-Orengo contó con el apoyo de la Universidad de California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10X PBSThermoFisherBP39920Se utiliza para bloquear y diluir anticuerpos.
20% PFAMicroscopía Electrónica Ciencias15713-SUtilizado como fijador (4% PFA)
70.000 MW DextranMillipore Sigma9004-54-0Utilizado para solución MV-2
Pinzas Adson FineScience Tools (FST)11006-12Utilizado para la extirpación de músculo y piel
Pinzas Adson, calidadFST91106-12Igual que el anterior pero más barato
Suero bovino albúmina (BSA)Millipore SigmaA7906-100GSe utiliza para la solución MV-3, bloqueo y diluyente de anticuerpos
Corning 100 μ m Colador de célulasMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m Colador de celdasMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork puntas de encuadernación bajaMillipore SigmaCLS4151Igual que a continuación pero más barato.
Cultrex Poly-D-LisineR& D3439-100-01Utilizado para el recubrimiento de portaobjetos
Burro anti-Cabra IgG-ALEXA 555ThermoA21432Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488ThermoA21202Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Burro anti-Conejo IgG-ALEXA 488ThermoA21206Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Burro anti-Conejo IgG-ALEXA 647ThermoA31573Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Burro anti-Rata IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Pico de tejido de doble puntaFST18067-11Se utiliza para la extirpación de meninges y plexo coroideo
Pinzas de #3c DumontFST11231-20Se utiliza para la manipulación de tejidos más delicados y/o pequeños del SNC (como la hipófisis)
Pinzas Dumont #7FST11274-20Se utilizan para la disección y manipulación del SNC
Pinzas Dumont #7, estudianteFST91197-00Igual que el anterior pero
Puntas ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention másEppendorf22493008Mejor calidad que las puntas anteriores (más caras).
Pinzas de Graefe extrafinas, dentadasFST11151-10Se utilizan para la extracción de huesos
Tijeras finas, afiladasFST14060-09Se utilizan para la extracción de saco dural de cerdo y macaco
Mortero de vidrio 1,5 mL Homogeneizador de tubo de microcentrífuga Homogeneizador, paquete de 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Se utiliza para el hipotátalo y la hipófisis de pequeños vetebrados.
Cabra anti-CXCL12, biotiniladoPeproTech500-P87BGBTSe utiliza como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Dilución recomendada: 1:20.
Cabra anti-JAM-BR& DAF1074Se utiliza como anticuerpo primario para evaluar la neuroinflamación. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Cabra anti-ratón IgG-ALEXA 488ThermoA11001Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Cabra anti-ratón IgG-ALEXA 555ThermoA21424Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Cabra anti-PDGFRβR& DAF1042Se utiliza como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Cabra anti-Conejo IgG-ALEXA 555ThermoA21249Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Cabra anti-Conejo IgG-DyLight 488Thermo35552Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Cabra anti-Rata IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.
Pinzas Graefe, punta curvada, 1X2 dientesFST11054-10Uso para la sujeción y agitación de la red de filtro de nailon
HBSS, tampón 1X con calcio y magnesioCorning21-022-CMUtilizado para solución MV-1
HEPES, tampón líquido 1MCorning25-060-CIUtilizado para la solución MV-1
Isolectina GS-IB4-Biotina-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Glicoproteína aislada de la leguminosa Griffonia simplicifolia que se une a los residuos de D-galactosil del glicocálido de las células endoteliales. Se utiliza para microbuques del SNC aviar y porcino. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Tijeras LaGrange, dentadasFST14173-12Utilizadas para la disección de cráneo y laminectomía (excepto cerdo y macaco)
Portaobjetos Millicell EZ Unidad de 8 pocillosMillipore Sigma PEZGS0816
Ratón anti-CLDN5Thermo35-2500Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Ratón anti-GGT1Abcamab55138Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Ratón anti-humano CD31 R& DBBA7Se utiliza como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de los primates. Concentración recomendada: 16,5 μ g/mL.
Ratón anti-NFMThermoRMO-270Se utiliza como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Ratón anti-αSMAThermoMA5-11547Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Dilución recomendada de 1:200.
Red filtrante de nylon, rolloMillipore SigmaNY6000010Discos de red filtrante cortados con láser a 13 mm de diámetro. Se utiliza para el hipotátalo y la hipófisis de pequeños vetebrados.
Redes filtrantes de nylon, 25 mmMillipore SigmaNY2002500Se utilizan en la mayoría de los tejidos del SNC de los vertebrados pequeños, excepto el hipotálamo y la hipófisis. Se utiliza para el hipotálamo y la hipófisis de macacos y cerdos.
Redes filtrantes de nylon, 47 mmMillipore SigmaNY2004700Se utiliza para tejidos del SNC de macacos y cerdos, excepto el hipotálamo y la hipófisis.
Reactivo antidecoloración ProLong Gold con DAPIThermoFisherP36935Se utiliza para cubrir portaobjetos.
Conejo anti-AQP4Millipore SigmaA5971Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Dilución recomendada de 1:200.
Millipore Sigma deconejoSAB2107967Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Conejo anti-NG2Millipore SigmaAB5320Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Dilución recomendada de 1:200.
Anti-OSP de conejoAbcamab53041Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 1 μ g/mL.
Conejo anti-VE-CadherinAbcamab33168Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Conejo anti-ZO-1Thermo61-7300Utilizado como anticuerpo primario en microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Rata anti-CD31Becton DickinsonBD 550274Se utiliza como anticuerpo primario para los microvasos del SNC murino. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Rat anti-GFAPThermo13-0300Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Dilución recomendada de 1:200.
Rata anti-VCAM-1Becton DickinsonBD 553329Se utiliza como anticuerpo primario para evaluar la neuroinflamación. Concentración recomendada: 5 μ g/mL.
Solución estéril de Ringer, FrogAldon CorporationIS5066Utilizado para la anestesia amfibiana
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355Se utiliza como anticuerpo secundario para marcar anticuerpos primarios biotinilados. Dilución recomendada de 1:500.
Estreptavidina-ALEXA 647ThermoS32357Se utiliza como anticuerpo secundario para marcar anticuerpos primarios biotinilados. Dilución recomendada de 1:500.
Tijeras quirúrgicas, afiladasFST14002-12Utilizadas para la extirpación de músculo y piel
Tijeras quirúrgicas, afiladas-romasFST14001-16Utilizadas para la decapitación (excepto cerdo y macaco)
Swinnex Portafiltros, 13 mmMillipore SigmaSX0001300Modificado por corte láser. Se utiliza para el hipotátalo y la hipófisis de pequeños vetebrados.
Portafiltros Swinnex, 25 mmMillipore SigmaSX0002500Modificado por corte láser. Se utiliza en la mayoría de los tejidos del SNC de los vertebrados pequeños, excepto el hipotálamo y la hipófisis. Se utiliza para el hipotálamo y la hipófisis de macacos y cerdos.
Portafiltros Swinnex, 47 mmMillipore SigmaSX0004700Modificado por corte láser. Se utiliza para tejidos del SNC de macacos y cerdos, excepto el hipotálamo y la hipófisis.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277Se utiliza para bloquear y diluir anticuerpos.
Wheaton 120 Vac Agitador aéreoVWR (Proveedor DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)Se utiliza para tejidos del SNC de macacos y cerdos con trituradora de tejidos de 55 mL, excepto el hipotálamo y la hipófisis.
Trituradora de tejidos Wheaton Potter-Elvehjem con mortero de PTFE, 10 mLVWR (Proveedor DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)Se utiliza en la mayoría de los tejidos del SNC de los vertebrados pequeños, excepto el hipotálamo y la hipófisis. Se utiliza para el hipotálamo y la hipófisis de macacos y cerdos.
Trituradora de tejidos Wheaton Potter-Elvehjem con mortero de PTFE, 55 mLVWR (Proveedor DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)Se utiliza para tejidos del SNC de macacos y cerdos, excepto el hipotálamo y la hipófisis.
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Referencias

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