Aquí, describimos un protocolo simple y reproducible del modelo de ratón de infección para evaluar la atenuación de las cepas modificadas genéticamente de Pseudomonas aeruginosa en comparación con la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) aprobada por escherichia coli para aplicaciones comerciales.
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Artículo de método
Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
Los microorganismos son genéticamente versátiles y diversos y se han convertido en una fuente importante de muchos productos comerciales y biofarmacéuticos. Aunque algunos de estos productos son producidos naturalmente por los organismos, otros productos requieren ingeniería genética del organismo para aumentar los rendimientos de la producción. Las cepas avirulentes de Escherichia coli han sido tradicionalmente la especie bacteriana preferida para la producción de productos biofarmacéuticos; sin embargo, algunos productos son difíciles de producir para E. coli. Por lo tanto, las cepas avirulentes de otras especies bacterianas podrían proporcionar alternativas útiles para la producción de algunos productos comerciales. Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa común y bien estudiada que podría proporcionar una alternativa adecuada a E. coli. Sin embargo, P. aeruginosa es un patógeno humano oportunista. Aquí, detallamos un procedimiento que se puede utilizar para generar cepas no patógenas de P. aeruginosa a través de deleciones genómicas secuenciales utilizando el plásmido pEX100T-NotI. La principal ventaja de este método es producir una cepa sin marcadores. Este método se puede utilizar para generar cepas P. aeruginosa altamente atenuadas para la producción de productos comerciales, o para diseñar cepas para otros usos específicos. También describimos un modelo de ratón simple y reproducible de infección sistémica bacteriana a través de la inyección intraperitoneal de cepas de prueba validadas para probar la atenuación de la cepa genéticamente diseñada en comparación con la cepa BL21 aprobada por la FDA de E. coli.
Introducción
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano oportunista que puede causar enfermedades potencialmente mortales en humanos, especialmente en los inmunocomprometidos. La patogenicidad de P. aeruginosa se debe a la expresión de muchos factores de virulencia, incluyendo proteasas y lipopolisacáridos, así como su capacidad para formar una biopelícula protectora1. Debido a su capacidad para producir factores de virulencia y causar enfermedades en los seres humanos, el uso de P. aeruginosa para hacer productos comerciales presenta problemas de seguridad. Cepas no patógenas de E. coli se han utilizado tradicional....
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Protocolo
Antes de comenzar los experimentos con animales, el protocolo que se utilizará debe ser aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC). La aprobación para el protocolo descrito se obtuvo a través de la IACUC en la Universidad Marshall (Huntington, WV, EE.UU.).
1. Diseño de plásmido
- Para generar una eliminación genética utilizando el plásmido pEX100T-NotI, clonar las regiones de ADN flanqueando la secuencia de eliminación deseada e insertar en el sitio de restricción NotI del plásmido. La plaquita de plásmido debe contener unos 500 nucleótidos aguas arriba de la secuencia de destino directamente adyacentes a u....
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Resultados
Como se muestra en la Figura 2,la eliminación genómica dirigida se puede confirmar utilizando PCR de colonia con imprimaciones específicas que amplifican la región de interés. Las colonias que llevan una eliminación genómica producirán un tamaño de banda de PCR más corto en comparación con las colonias de tipo salvaje. Una pantalla PCR de 10-12 colonias suele ser suficiente para detectar al menos una colonia que lleve la eliminación dirigida. Si no se detecta.......
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Discusión
El plásmido pEX100T-Not1 es un mediador eficiente de eliminaciones genómicas secuenciales que están libres de marcadores y en fotograma. Cuando se diseñan cepas bacterianas para la virulencia atenuada, la eliminación de secuencias genéticas enteras en lugar de generar mutaciones puntuales disminuye la probabilidad de reversión a un fenotipo virulento. Además, cada deleción del gen de la patogenicidad atenúa aún más al patógeno, reforzando la estabilidad de la atenuación.
Este método también se.......
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Divulgaciones
El autor Hongwei D. Yu es el Director Científico y Cofundador de Progenesis Technologies, LLC.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R44GM113545 y P20GM103434.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de 0,2 mL con tapas planas | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| Jeringa de 1 mL | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| Cubeta de poliestireno desechable de 1,5 mL | Fisher Scientific Fisher Scientific | 14955127 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Viales criogénicos de 2,0 mL Corning | 430659 | vía Fisher Scientific | |
| Aguja 27G | BD | 14-821-13B | vía Fisher Scientific |
| Tubos de 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | vía Fisher |
| Scientific Accu block Labnet digital de baño seco digital | NC0205808 | vía Fisher Scientific | |
| centrífuga de sobremesa 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | vía Fisher Scientific |
| Microcentrífuga de sobremesa | Sorvall | 75-003-287 | vía Fisher |
| Scientific Incubadora de armario | VWR | 1540 | |
| Sal disódica de carbenicilina | Fisher Scientific | ||
| , poliestireno | Fisher Scientific | 14-956-6D | vía Fisher |
| Scientific Asas de inoculación desechables Fisher | Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | o método/proveedor preferido |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | o método/proveedor preferido |
| EcoRI-HF, endonucleasa de restricción | New England BioLabs | R3101L | |
| Cubetas de electroporación | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Kit de |
| ligadura de ADN Scientific FastLink II | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Sulfato de gentamicina | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Mezcla maestra incolora | Promega | M7833 | a través de Fisher |
| Scientific Isothesia Isoflurano | Henry Schein Salud Animal | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Serie III Sistema de imagen in vivo | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| monosulfato de kanamicina | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarosa | Genemate | 3120-500 | a través de Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | a través de Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporador | BioRad | 1652100 | |
| Agar noble, ultrapuro | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | a través de Fisher Scientific |
| NotI-HF, endonucleasa de restricción | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | a través de Fisher Scientific |
| Polvo salino tamponado con fosfato | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prisma 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas agar | de aislamiento Difco | 292710 | a través de Fisher Scientific |
| Pseudomonas aislamiento caldo | Alpha Biosciences | P16-115 | Lote hecho a medida |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | o método/proveedor preferido |
| Incubadora de agitación | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | batido a 200 rpm |
| Termociclador SimpliAmp | Applied Biosystems | A24811 | |
| Leche desnatada | Difco | DF0032-17-3 | vía |
| Placas pequeñas de Fisher Scientific (100 ø x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Espectrofotómetro | Bio-Rad | 170-2525 | o método/proveedor preferido |
| de sacarosa Palillos | Fisher Scientific | S5-500 | |
| , redondos | Diamante | Cualquier marca de palillos de dientes, esterilizados en autoclave | |
| Kit de clonación TOPO TA, para secuenciar | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Filtros para sistema de anestesia | Perkins y Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Calibre de sistema de anestesia | gaseosa Life Sciences/Xenogen |
Referencias
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuate....
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Reimpresiones y permisos
