Establecimiento y caracterización de esferoides de tumores neuroendocrinos de intestino delgado

Summary

Los tumores neuroendocrinos (NET) se originan a partir de células neuroendocrinas de la cresta neural. Son de crecimiento lento y desafiantes para la cultura. Presentamos una estrategia alternativa para cultivar NETs desde el intestino delgado cultándolos como esferoides. Estos esferoides tienen marcadores de red intestinal pequeña y se pueden utilizar para pruebas de drogas.

Abstract

Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) son cánceres raros que se originan a partir de células enterocromafina del intestino. La investigación en este campo ha sido limitada porque se han generado muy pocas líneas celulares SBNET derivadas de pacientes. Las células SBNET bien diferenciadas son de crecimiento lento y son difíciles de propagar. Las pocas líneas de celda que se han establecido no están fácilmente disponibles, y después del tiempo en el cultivo puede no seguir expresando características de las celdas NET. La generación de nuevas líneas celulares podría tardar muchos años ya que las células SBNET tienen un tiempo de duplicación largo y se necesitan muchos pasos de enriquecimiento para eliminar los fibroblastos asociados al cáncer que se dividen rápidamente. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado un protocolo para cultivar células SBNET de tumores extirpados quirúrgicamente como esferoides en la matriz extracelular (ECM). El ECM forma una matriz tridimensional que encapsula las células SBNET e imita el microambiente tumoral para permitir que las células SBNET crezcan. Aquí, caracterizamos la tasa de crecimiento de los esferoides de SBNET y describimos métodos para identificar marcadores SBNET utilizando microscopía de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica para confirmar que los esferoides son células tumorales neuroendocrinas. Además, utilizamos esferoides SBNET para probar la citotoxicidad de la rapamicina.

Introduction

Los tumores neuroendocrinos del intestino delgado (SBNET) se originan en las células enterocromafina del intestino delgado. Aunque los SBNET son generalmente conocidos por crecer lentamente, comúnmente hacen metástasis en el hígado¹. Si bien la extirpación quirúrgica o la ablación tumoral se pueden considerar en muchos casos, la recurrencia es casi universal y, por lo tanto, la terapia médica desempeña un papel importante en el manejo. Se han invertido enormes esfuerzos para generar nuevas líneas celulares SBNET para pruebas de drogas. Sin embargo, ha habido muy poco éxito. Sólo se han notificado 6 líneas de celda SBNET (KRJ-I, CND2, GOT1, P-ST....

Protocol

Todos los experimentos con muestras de tumores neuroendocrinos humanos han sido aprobados por el comité IRB de hospitales y clínicas de la Universidad de Iowa (número de protocolo 199911057). En la Tabla de materialesse describe una lista de todos los materiales y equipos. En la Tabla 1se encuentra una lista de medios de crecimiento y soluciones clave.

1. Recogida de tumor neuroendocrino del intestino delgado (SBNET) y disociación celular

1. Obtener muestras de SBNET del paciente resecadas después de la confirmación de los tejidos tumorales del Núcleo de Patología Quirúrgica.
2. Cortar sBNET e....

Results

Actualmente sólo hay 2 líneas celulares SBNET establecidas y publicadas^2,3,4,5 y no están fácilmente disponibles para muchos investigadores. Aquí, proponemos cultivar SBNET como esferoides en ECM y utilizar esto como un modelo alternativo para estudiar la sensibilidad a los medicamentos SBNET. Se recogió un tumor derivado del paciente de un SBNET que hizo metástasis en el hígado, se digiere par.......

Discussion

Los cultivos 3D tumorales se han convertido en un recurso valioso para las pruebas de fármacos preclínicos^15. Recientemente se han establecido varios biobancos organoides tumorales a partir de tumores de cáncer de mama y de cáncer de próstata^16,17. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para el cultivo de SBNET como esferoides y un método simple y rápido para validar los cultivos de esferoides para marcadores NET por inmuno.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-conejo FITC	Jackson ImmunoResearch	11-095-152	Acoplamiento de anticuerpos secundarios a un fluoróforo verde
Solución de recuperación de antígenos	Agilent Dako	S2367	a pH 9 para la preparación de portaobjetos para IHC
Autostainer Link 48	Agilent Dako	No disponible	Sistema automatizado para la tinción de anticuerpos
Contenedor de congelación celular	Thermo Scientific	5100-0001	Contenedor para congelar células
CellSence	Olympus	Versión 1.18	Software informático para el uso de microscopio fluorescente
Anticuerpo Chromogranin A	Abcam-45179	RB-9003-PO	Anticuerpos para el FI
Anticuerpo Chromogranin A (clon LK2H10)	Thermo Scientific	MA5-13096	Anticuerpos para IHC
Colagenasa	Sigma	C0130	Enzima para la digestión de tejido tumoral
DMEM	Gibco	11965-092	Medio para la preparación de tejidos
DMEM/F12	Gibco	11320-033	Medio para cultivos de organoides
DMSO	Sigma	D8418	Disolvente para disolver fármaco
ADNasa	Sigma	DN25	Enzima para la digestión de tejido tumoral
Ethidium Homodimer	Chemodex	CDX-E0012-T1E Colorante de	unión a ADN y ARN
FBS	Gibco	16000044	Reactivo para medios de cultivo
Microscopio fluorescente	Olympus	CKX35	Microscopio para tomar imágenes de esferoides SBENT
Glutamina	Gibco	A2916801	Reactivo para medios de cultivo
ImageJ	Institutos Nacionales de Salud	Versión 1.51	Software informático para imágenes análisis
Insulina	Sigma	I0516	Reactivo para medios de cultivo
Matrigel	Corning		356235 Matriz para incrustar y anclar organoides
Medio de montaje (VECTASHIELD)	Vector Laboratories	H-1200	Fijador para células marcadas con una tinción nuclear
Nicotinamida	Sigma	72340	Reactivo para medios
de cultivoParaformaldehído	Microscopía Electrónica Ciencias	15710	Reactivo para fijar células
PEN/STREP	Gibco	15140-122	Reactivo para medios de cultivo
PT Link	Agilent Dako	No disponible	Sistema automatizado para preparar portaobjetos para la tinción IHQ
Rapamicina	Alfa Aesar	J62473	Fármaco que puede inhibir el crecimiento de NET
Anticuerpos secundarios para IHQ	Agilent Dako	K8000	Anticuerpos secundarios contra IHQ mediante el sistema EnVision FLEX basado en polímeros
Anticuerpo SSTR2	GeneScritp	A01591	Anticuerpos contra IF
Anticuerpo SSTR2 (clon UMB1)	Abcam	ab134152	Anticuerpos contra IHQ
Anticuerpo sinaptofisina	Abcam	32127	Anticuerpos contra IF
Anticuerpo sinaptofisina (clon DAK-SYNAP)	Agilent Dako	M7315	Anticuerpos para IHC
TritonX	Mallinckrodt	3555 KBGE	Reactivo para permeabilizar células
Y-2763 Inhibidor de ROCK	Adipogen	AG-CR1-3564-M005	Para mejorar la viabilidad de los esferoides SBNET después de la congelación y descongelación