Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

Summary

Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.

Abstract

Los mioblastos primarios son precursores proliferantes indiferenciados del músculo esquelético. Pueden ser cultivados y estudiados como precursores musculares o inducidos para diferenciarse en etapas posteriores del desarrollo muscular. El protocolo proporcionado aquí describe un método robusto para el aislamiento y el cultivo de una población altamente proliferativa de células mioblastecas de explantes musculares esqueléticos de ratón adulto joven. Estas células son útiles para el estudio de las propiedades metabólicas del músculo esquelético de diferentes modelos de ratón, así como en otras aplicaciones aguas abajo como la transfección con ADN exógeno o la transducción con vectores de expresión viral. El nivel de diferenciación y perfil metabólico de estas células depende de la duración de la exposición y de la composición de los medios utilizados para inducir la diferenciación de mioblastos. Estos métodos proporcionan un sistema robusto para el estudio del metabolismo de las células musculares de la ratón ex vivo. Es importante destacar que, a diferencia de los modelos in vivo, los métodos descritos aquí proporcionan una población celular que se puede ampliar y estudiar con altos niveles de reproducibilidad.

Introduction

Aunque a menudo se cita como una indicación de la salud metabólica general, múltiples estudios han demostrado que el índice de masa corporal (IMC) en adultos mayores no se asocia consistentemente con un mayor riesgo de mortalidad. Hasta la fecha, el único factor que ha demostrado ser consistente con la reducción de la mortalidad en esta población es el aumento de la masa muscular¹. El tejido muscular representa una de las mayores fuentes de células sensibles a la insulina en el cuerpo, y por lo tanto es crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica general². La activación del tejido muscular esquelético a trav....

Protocol

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de Scripps Research.

1. Recolección y procesamiento de explantes de tejido muscular

1. El día anterior a la disección, esterilizar todos los equipos de disección (fórceps, cuchillas de afeitar y tijeras) y preparar todos los medios necesarios: solución salina tamponada de fosfato (PBS), MB Deplating (12,5 ml de DMEM, 12,5 ml de HAMS F12, 20 ml de bovina fetal inactivada por calor suero (FBS), 5 ml de suplemento medio de líquido amniótico) y Solución de recubrimiento (24 ml de DMEM, 24 ml de HAMS F12, 1,7 ml de colágeno, 1 ml de matrigel).
2. El día de la disección, cubra un pla....

Results

Siguiendo la Sección 1 del protocolo proporcionado debe producir células primarias que emergen de los explantes que serán visibles bajo un microscopio de luz estándar(Figura 2). Se verá una población de células heterogéneas creciendo fuera y rodeando cada explantación de tejido muscular. Los mióblastos aparecerán como esferas pequeñas, redondas y brillantes. Siguiendo la Sección 2 del protocolo producirá cosechas tempranas de mioblastos a partir de explantes .......

Discussion

El músculo esquelético es vital para el establecimiento y mantenimiento de la homeostasis metabólica^11. El estudio de la fisiología muscular se complica por la variabilidad interindividual, así como la dificultad para obtener muestras, especialmente en el caso de estudios en humanos. Se ha demostrado que los miotubos primarios cultivados recapitulan muchas características de la fisiología muscular, incluyendo la homeostasis de calcio^12,la regeneración del tejido muscular da.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
recubrimiento:
DMEM	Gibco	10569010	Agregue siempre gentamicina (1:1,000 por volumen) antes de usar; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Agregue siempre gentamicina (1:1,000 por volumen) antes de usar; 24 mL
	Collagen Life Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1
mLMedios de recubrimiento:
DMEM	Gibco	10569010	Agregue siempre gentamicina (1:1,000 en volumen) antes de usar; 12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Siempre agregue gentamicina (1:1,000 en volumen) antes de usar; 12.5 mL
de FBS	Life Technologies	16000044	20 mL; se puede comprar como FBS regular e inactivado por calor colocándolo en un 40 ° C Baño de agua durante 20 minutos
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Mioblast Medios:
DMEM	Gibco	10569010	Agregue siempre gentamicina (1:1,000 en volumen) antes de usar; 17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Siempre agregue gentamicina (1:1,000 en volumen) antes de usar; 17.5
mL Calor FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; se puede comprar como FBS regular e inactivado por calor colocándolo en un tanque de 40 ° C Baño de agua durante 20 min
Amniomax	Life Technologies	12556023	5
mLMedios de diferenciación:
DMEM	Gibco	10569010	Agregue siempre gentamicina (1:1,000 en volumen) antes de usar; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Siempre agregue gentamicina (1:1,000 en volumen) antes de usar; 24 mL
Calor Suero de caballo inactivado	Sigma	H1138	1,5 mL
Insulina-Selenio-Transferrina	Life Technologies	41400045	0,5 mL
Otros materiales:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicina	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma 472301		Preparar como 10% DMSO en Myoblast Medios para congelar células
Pinzas	Cualquier
hoja de afeitar	Cualquier
tijera Cualquier
papel Whatman	VWR	21427-648
Placa de 60 mm	VWR	734-2318
Placa de 10 cm	VWR	25382-428 (CS)
Matraces T25	ThermoFisher	156367
Matraces T75	Tubos
ThermoFisher (15 mL)	BioPioneer	CNT-15<
fuerte>Tasas de consumo de oxígeno:
Seahorse XFe96 Analizador			Agilent Seahorse XFe96Instrumento utilizado para medir las tasas de consumo de oxígeno leídas por acidificación del medio extracelular
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	placas de 96 pocillos para uso en el analizador XFe96
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	se pueden comprar a otros proveedores una vez que se establece el ensayo; algunas recomendaciones se enumeran a continuación
Seahorse XF Palmitate-BSA Sustrato FAO	Agilent	102720-100	se pueden comprar a otros proveedores una vez que se establece el ensayo; algunas recomendaciones se enumeran a continuación
Ácido palmítico	Sigma	P5585-10G	para la medición de la oxidación de ácidos grasos
Carnitina	Sigma	C0283-5G	para la medición de la oxidación de ácidos grasos
Etomoxir	Sigma	E1905	para la medición de la oxidación de ácidos grasos
BSA	Sigma	A7030	utilizado como control o en conjugación con ácido palmítico para su uso en la medición de la oxidación de ácidos grasos